Extraccion de dna por tsnt

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Nombre del estudiante: Luis Felipe Torres Garza | Número de lista |
Fecha: 20 de agosto de 2012 | |

RÚBRICA DE EVALUACIÓN

| PUNTOS | PUNTOS ACREDITADOS |
FORMATO | 10 | |
OBJETIVO | 10 | |
FUNDAMENTO | 15 | |
MATERIALES Y EQUIPOS | 10 | |
PROCEDIMIENTO | 20 | |
RESULTADOS | 20 | |
RECOMENDACIONES Y CONCLUSIONES | 10 | |
BIBLIOGRAFÍA | 5 | |TOTAL | 100 | |

Preparación de DNA genómico a partir de levaduras(Pichia pastoris) |
Fecha20 de agosto de 2012 | Elaborado por:Luis Felipe Torres Garza. | Páginas6 |

OBJETIVO

Aislar DNA genómico a partir de la levadura Pichia pastoris usando la técnica TSNT e interpretar los resultados a partir de corrimiento en gel de electroforesis.


FUNDAMENTO

En la extracción de losácidos nucleicos, éstos se separan de cualquier otro compuesto proveniente de las células o del ambiente del cual se tomaron las muestras.

La técnica TSNT es una de las técnicas más empleadas en biología molecular para obtener DNA genómico de alta calidad. Su composición más frecuente es: Triton X, Tris-HCl, SDS, EDTA, NaCl, Proteinasa K.

Consta de 4 pasos: Homogenización (lisis celular),extracción de contaminantes (remoción de proteínas y RNA), precipitación y lavado del DNA y solubilización.

Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis para liberar al DNA del interior celular, para lo cual se
utilizan los buffers de extracción que contienen: 1) detergentes, como sodio dodecilo sulfato (SDS) un detergente aniónico que desnaturaliza las proteínas, eliminando susestructuras secundaria y terciaria (pero sin alterar los enlaces disulfuro y además confiere una carga negativa a cada proteína en proporción a su masa.) Triton X al 0.5%; 2) una molécula quelante (p. ej. EDTA, ácido etileno amino tetra acético), que tiene cuatro grupos carboxilo y dos grupos amino, cuya forma completamente de-protonizada puede unirse a cualquier complejo metálico en solución,quitando a los cationes de la solución para desestabilizar la membrana celular e inhibir a las DNAasas; 3) sales (p.ej. cloruro de sodio, NaCl), que forman una capa iónica suave que recubre al DNA protegiéndolo y ayudando a evitar su degradación; 4) Tris-HCl para mantener el pH de la solución estable; 5) proteínasa K para degradar proteínas o enzimas.

Posteriormente para la extracción decontaminantes se utiliza cloroformo; El cual es un disolvente orgánico que se emplea para la separación de fases, además extrae lípidos y restos de fenol.
Se realiza una centrifugación a una temperatura de 4°C formándose una fase acuosa y una orgánica encontrándose el DNA en la fase acuosa.

Para la precipitación del DNA se emplean etanol, isopropanol y butanol. Las moléculas de alcohol rodean el DNAimpidiendo que interactué con las moléculas de agua propiciando que el DNA precipite.

En la solubilización se re suspende con TE1X

La electroforesis constituye parte del procedimiento de análisis de los ácidos nucleicos y proteínas. La electroforesis nos ayuda a observar los ácidos nucleicos y proteínas al final del procedimiento. Esta técnica consiste en armar un gel de agarosa, conpequeños huecos en un extremo donde se deposita el DNA. El gel es sometido a corriente eléctrica de modo que el DNA, que es una molécula cargada negativamente, se desplaza por el gel hacia el polo positivo. Cuanto más pequeño es el fragmento de DNA más rápido se desplaza y llega hasta el extremo opuesto (en el corrimiento electroforético los segmentos de DNA migran a una velocidad inversamenteproporcional a su tamaño). Al preparar el gel se agrega la sustancia bromuro de etidio que se intercala entre las bases del DNA y permite visualizarlo al ser iluminado con luz UV. Las bandas corresponden a los fragmentos de DNA amplificados.

MATERIALES Y EQUIPOS

Equipos
Agitador vortex | Incubadora a 37°C, con agitación |
Autoclave | Juego de micropipetas |
Campana bacteriológica |...
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