Extraccion de RNA

Páginas: 7 (1654 palabras) Publicado: 21 de octubre de 2013
Universidad de la Frontera
Facultad de Ingeniería y Ciencias
Departamento de Ciencias Químicas y Recursos Naturales

“Extracción de RNA total a partir de
tejido vegetal”

Alumno: Mauricio Arismendi
Profesora: Dra. Marjorie Reyes
Asignatura: Biología Molecular
Código: ICQ310
Carrera: Bioquímica

INTRODUCCION
1. Ácido Ribonucleico
Según Prescott et al. (2002), el Ácido Ribonucleico(RNA) está formado por ribonucleósidos de
adenina, guanina, citosina y uracilo (en lugar de timina). Tanto el DNA como en el RNA, los
nucleósidos se unen mediante grupos fosfato para formar largas cadenas de polinucleótidos. Las
diferencias en cuanto la composición química de las cadenas reside en su azúcar y en sus bases
pirimidínicas: el DNA tiene desoxirribosa y timina; el RNA tiene ribosay uracilo en lugar de timina.
(Figura 1)

Figura 1: Comparación entre DNA y RNA
2. Extracción de RNA
La Solución de Chomczynski con Fenol se utiliza fundamentalmente para purificar el RNA total,
aunque también se pueden purificar el DNA y las proteínas a partir de células y tejidos de origen
animal y vegetal, o de bacterias y levaduras. El RNA se purifica en tres pasos: un paso de lisiscelular y
homogenización con la Solución de Chomczynski con Fenol; adición de Cloroformo, el cual produce la
formación de dos fases, una acuosa, que contiene el RNA, y una orgánica, que contiene el DNA y las
proteínas; y un último paso de precipitación con Alcohol iso-Propílico. (Chomczynski & Sacchi, 1987)

“Los protocolos de extracción de RNA son similares a los de DNA, con algunasparticularidades,
especialmente las destinadas a evitar la actividad de las RNAsas. Estas enzimas son bastante estables y
activas por lo que es necesario extremar precauciones para evitarlas (uso de material estéril, tratamiento
de los buffers con inhibidores de RNAsas, etc) La lisis celular se realiza con sales de guanidina
(tiocianato de guanidina), que inhibe las RNAsas. En general, debido a la menorestabilidad de RNA y
la mayor dificultad de su extracción, esta generalmente se realiza mediante kits comerciales.” (Jiménez,
2003)
El RNA es químicamente mucho más reactivo que el DNA, esto se debe a que los residuos de ribosa
llevan grupos hidroxilo tanto en las posiciones 2' como en la 3', y ésto los vuelven presas fáciles para
ser degradados por las enzimas RNAsas. No hay métodos simplespara inactivar las RNAsas, ya que la
presencia de enlaces disulfuro, muchas RNAsas son resistentes a la denaturación por ebullición, y son
capaces de replegarse fácilmente una vez desnaturalizados. La mejor manera de prevenir los problemas
con las RNAsas, es evitar la contaminación. (Sambrook & Russell, 2001)
2.1. Dietilpirocarbonato (DEPC)
Es utilizado para inactivar las RNAsas que puedancontaminar soluciones. El DEPC destruye la
actividad enzimática de RNAsas principalmente, mediante etoxiformilacion de los grupos histidilo.
(Sambrook & Russel, 2001).
3. Determinación de la concentración de RNA
Según Fonseca et al. (2010) Las purinas y las pirimidinas de los ácidos nucleicos muestran una
absorción máxima a 260 nm, mientras que la lectura a 280 nm nos proporciona la cantidadde proteínas
en la muestra.
Para interpretar los resultados obtenidos, se debe tener en cuenta que:
-Una relación entre estas dos medidas cercana a 2 indica mayor pureza del DNA o RNA.
-Las absorbancias medidas a 260 nm no discriminan entre DNA y RNA.
Las absorbancias a 325 nm indican partículas contaminantes de las cubetas de lecturas
-Los contaminantes del DNA como los fenoles pueden serdeterminados mediante la evaluación del
material extraído a absorbancias de 230 nm.
-Este método de cuantificación debe realizarse en espectrofotómetros que tengan filtros para luz
ultravioleta.
Para determinar concentración de DNA, se utiliza la relación:
Para determinar la pureza del DNA, se establece:
-Una relación entre 1,8 y 2 indica que la absorción en el rango UV se debe a ácidos...
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