Extracción De La Tirosinasa Y DeTERMINACIÓN De Su Actividad En Algunos Vegetales

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLÍN
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE QUIMICA


EXTRACCIÓN DE LA TIROSINASA Y DETERMINACIÓN DE SU ACTIVIDAD EN ALGUNOS VEGETALES.



OBJETIVOS:

• Extraer la enzima tirosinasa de diferentes fuentes (banano, manzana y papa).
• Determinar la actividad de la tirosinasa, usando como sustrato L-DOPA.
•Comparar la actividad de la enzima en diferentes fuentes y bajo diferentes condiciones: calentamiento y en presencia de un inhibidor (NaCN).

MARCO TEORICO.


1 PARDEAMIENTO ENZIMATICO.

La coloración café oscuro que se va formando en la superficie de algunas frutas y vegetales cuándo se cortan, se denomina pardeamiento, y se debe a la acción de la enzima tirosinasa sobre el aminoácidotirosina, que en presencia de oxigeno, lo va convirtiendo secuencialmente en dopa, dopaquinona y dopacromo (café oscuro), hasta que termina en un pigmento muy oscuro llamado melanina.






La secuencia de reacciones es la siguiente:




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En esta práctica se pretende extraer la enzima tirosinasa de varias fuentes vegetales (banano, manzana y papa), y ponerla aactuar sobre el sustrato L-dopa, que se usa como droga antiparkinsoniana, hasta convertirlo en el compuesto dopacromo, que es de color café oscuro; la concentración de éste se puede seguir fotocolorimétricamente a una λ de 420 nm. que es donde presenta su máxima absorción.


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La medida de la absorbancia a través del tiempo sirve para cuantificar la velocidad de la reacción entérminos de la cantidad de dopacromo que se va formando, o de L-DOPA que va reaccionando:


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2 OBTENCION DE EXTRACTOS ENZIMATICOS.

Se conoce como extracto enzimático a una fracción de material animal, vegetal o microbiano, que contiene una mezcla de varias sustancias pero que se caracteriza por presentar actividad de una o varias enzimas.
La preparación deun extracto enzimático se inicia con la adición al material seleccionado de una solución amortiguadora, que garantice la conservación de la actividad de la enzima o enzimas objeto de la extracción. Con el fin de obtener un extracto lo más purificado posible, se acostumbra someter el material a uno o varios de los siguientes procedimientos:
• Ruptura mecánica por molido o trituración.
•Separación de la enzima por autólisis: autodigestión del material por otras enzimas de la misma célula.
• Adición de la enzima lisozima, que hidroliza el polisacárido mureína de la pared celular.
• Congelación y descongelación rápida.
• Tratamiento con ultrasonido.
• Separación de residuos poco solubles por filtración y centrifugación.
El material así obtenido se denominaextracto bruto, y se puede emplear para hacer ensayos de actividad enzimática. Si se desea un extracto con mayor porcentaje de pureza, será necesario recurrir a una o varias de las siguientes técnicas:
• Purificación por diálisis a través de membranas semipermeables.
• Ultrafiltración bajo presión usando membranas de poros muy pequeños.
• Precipitación fraccionada en frió con unsolvente orgánico.
• Filtración por gel usando sefadex, poliacrilamida o agarosa.
• Cromatografía de intercambio iónico.
• Electroforesis.
• Ultracentrifugación.
• Cromatografía de afinidad.
Los últimos 5 métodos se emplean específicamente para obtener enzimas puras y cristalizadas, destacándose la cromatografía de afinidad, que consiste en unir selectivamente laenzima a una columna que contiene una sustancia, que puede ser un inhibidor reversible, que se enlaza únicamente a ella. Cuando se pasa el extracto sobre la columna, todas las sustancias la atraviesan, excepto la enzima en cuestión que forma un complejo con el ligando. La enzima retenida se recupera de la columna mediante un solvente apropiado.





3 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA....