Extracción De Protoplastos
Páginas: 5 (1168 palabras)
Publicado: 16 de abril de 2012
Práctica Extracción de protoplastos
ABSTRACT
We performed isolation of plant protoplasts by enzymatic method, which is the incubation of cells in a mixture of enzymes that degrade the cell wall. We used the leaves of the plant, which was first in darkness, the leaves were cut transversely, the leaves are also subjected to an osmotic solution, then an enzymatic solution that consisted ofcellulases, pectinases and hemicellulases, later joined the centrifuge, and placed in solutions for washing and flotation centrifugation was referred again and finally extracted protoplasts were counted, which were 5000 protoplasts.
Palabras claves: Extracción de protoplastos, método enzimático, solución enzimática.
INTRODUCCIÓN
El fitomejoramiento se ha realizado desde hace muchos añosen búsqueda de mejoras en las plantas. Se realiza el fitomejoramiento tradicional, pero como solución para obtener mejores resultados es que se practica el cultivo de protoplastos, ya que estos permiten el desarrollo de plantas con las características deseadas, por la manipulación del tejido celular que se realiza (Roca, 1991).
Un protoplasto esta definido por la célula que pierde su paredcelular (Smith, 1997). Para la manipulación de los componentes vivos de la célula con su membrana plasmática es que se realiza el aislamiento de protoplastos.
Para poder realizar el aislamiento de protoplastos se debe inducir a las células a plasmólisis, en donde por osmosis pierden al agua, disminuyendo su tamaño permitiendo su separación de la pared celular.
Existen diversos métodos desarrollados através de estudios para el aislamiento de protoplastos. Entre los procedimientos se encuentra el mecánico, el cual no presenta gran exactitud debido a que se realizan cortes al azar a la pared celular para la liberación de los protoplastos, pero es un proceso de valor histórico.
Además del procedimiento mecánico se practica el método enzimático, el cual presenta mayores rendimientos pero senecesitan varios cuidados en cuanto al tipo y concentración de enzima, el origen del material, el procedimiento, entre otros. El procedimiento enzimático se puede llevar a cabo de dos maneras; mediante una o dos etapas. Cuando se realiza mediante una etapa en la solución de enzimas se agregan tanto las enzimas de degradación de la pared celular, como las de aislamiento de protoplastos. Mediante dosetapas se agregan las enzimas de degradación y aislamiento por separado (Gómez & García, 1993).
METODOLOGÍA
Se realizó el aislamiento de protoplastos a plantas de vainillas Vanilla planifolia cultivadas en el laboratorio de biotecnología. El cual creció en un medio MS solidificado con agar y fue puesta en oscuridad, las cuales han sido desarrolladas en forma in vitro, se tomó un gramo de estashojas, para así cortarlas en forma de tijeras, seguidamente se colocaron en una solución osmótica (3ml de manitol) durante 30 minutos en el agitador orbital, posteriormente se incorporó a una solución enzimática (4ml) durante una hora, esta solución presentaba celulasas, pectinasas y hemicelulosas. Seguidamente se colocó la muestra en la centrifuga a 700 revoluciones por cinco minutos a 25º, luegose sometió a la solución de lavado y a la solución de flotación, en donde de nuevo se colocó en la centrifuga, para finalmente contabilizar los protoplastos mediante el uso de un microscopio y una cámara de conteo. Para averiguar el número de protoplastos se utilizó la formula:
[pic]
[pic]
[pic]
En donde #C, P, D, Fc y #CC corresponden a cantidad cloroplastos, profundidad, distancia,factor de conversión y campos contados, respectivamente.
RESULTADO Y DISCUSIÓN
El aislamiento de protoplastos mediante el método enzimático presenta gran facilidad y mayor velocidad en la obtención de los protoplastos, se realizó a plantas en oscuridad, esto con el fin de que las plantas no presentaran almidones ya que al someter las plantas en oscuridad se erradican la mayor parte de...
ABSTRACT
We performed isolation of plant protoplasts by enzymatic method, which is the incubation of cells in a mixture of enzymes that degrade the cell wall. We used the leaves of the plant, which was first in darkness, the leaves were cut transversely, the leaves are also subjected to an osmotic solution, then an enzymatic solution that consisted ofcellulases, pectinases and hemicellulases, later joined the centrifuge, and placed in solutions for washing and flotation centrifugation was referred again and finally extracted protoplasts were counted, which were 5000 protoplasts.
Palabras claves: Extracción de protoplastos, método enzimático, solución enzimática.
INTRODUCCIÓN
El fitomejoramiento se ha realizado desde hace muchos añosen búsqueda de mejoras en las plantas. Se realiza el fitomejoramiento tradicional, pero como solución para obtener mejores resultados es que se practica el cultivo de protoplastos, ya que estos permiten el desarrollo de plantas con las características deseadas, por la manipulación del tejido celular que se realiza (Roca, 1991).
Un protoplasto esta definido por la célula que pierde su paredcelular (Smith, 1997). Para la manipulación de los componentes vivos de la célula con su membrana plasmática es que se realiza el aislamiento de protoplastos.
Para poder realizar el aislamiento de protoplastos se debe inducir a las células a plasmólisis, en donde por osmosis pierden al agua, disminuyendo su tamaño permitiendo su separación de la pared celular.
Existen diversos métodos desarrollados através de estudios para el aislamiento de protoplastos. Entre los procedimientos se encuentra el mecánico, el cual no presenta gran exactitud debido a que se realizan cortes al azar a la pared celular para la liberación de los protoplastos, pero es un proceso de valor histórico.
Además del procedimiento mecánico se practica el método enzimático, el cual presenta mayores rendimientos pero senecesitan varios cuidados en cuanto al tipo y concentración de enzima, el origen del material, el procedimiento, entre otros. El procedimiento enzimático se puede llevar a cabo de dos maneras; mediante una o dos etapas. Cuando se realiza mediante una etapa en la solución de enzimas se agregan tanto las enzimas de degradación de la pared celular, como las de aislamiento de protoplastos. Mediante dosetapas se agregan las enzimas de degradación y aislamiento por separado (Gómez & García, 1993).
METODOLOGÍA
Se realizó el aislamiento de protoplastos a plantas de vainillas Vanilla planifolia cultivadas en el laboratorio de biotecnología. El cual creció en un medio MS solidificado con agar y fue puesta en oscuridad, las cuales han sido desarrolladas en forma in vitro, se tomó un gramo de estashojas, para así cortarlas en forma de tijeras, seguidamente se colocaron en una solución osmótica (3ml de manitol) durante 30 minutos en el agitador orbital, posteriormente se incorporó a una solución enzimática (4ml) durante una hora, esta solución presentaba celulasas, pectinasas y hemicelulosas. Seguidamente se colocó la muestra en la centrifuga a 700 revoluciones por cinco minutos a 25º, luegose sometió a la solución de lavado y a la solución de flotación, en donde de nuevo se colocó en la centrifuga, para finalmente contabilizar los protoplastos mediante el uso de un microscopio y una cámara de conteo. Para averiguar el número de protoplastos se utilizó la formula:
[pic]
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En donde #C, P, D, Fc y #CC corresponden a cantidad cloroplastos, profundidad, distancia,factor de conversión y campos contados, respectivamente.
RESULTADO Y DISCUSIÓN
El aislamiento de protoplastos mediante el método enzimático presenta gran facilidad y mayor velocidad en la obtención de los protoplastos, se realizó a plantas en oscuridad, esto con el fin de que las plantas no presentaran almidones ya que al someter las plantas en oscuridad se erradican la mayor parte de...
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