Extracto crudo
Páginas: 7 (1688 palabras)
Publicado: 29 de agosto de 2012
Resultados & Discusión / Extractos Crudos 122
EXTRACTOS CRUDOS
Características generales El contenido de proteínas del extracto crudo obtenido a partir del látex de los frutos de Araujia angustifolia fue de 1,5 mg/ml y de 5,4 mg/ml para el de Araujia hortorum. Empleando las técnicas mencionadas en Materiales y Métodos se pudieron detectar varias actividades hidrolíticas en los extractoscrudos estudiados. Ambos extractos mostraron actividad proteásica, amidásica, esterásica, poligalacturonidásica y pectinmetilesterásica. Con los métodos empleados no exhibieron actividades ramnogalacturonidásica, xilanásica, metilcelulásica y carboxipeptidásica. La principal actividad catalítica observada fue la proteolítica. Para conocer el intervalo de tiempo en que se mantenía una correlación linealentre velocidad de reacción y tiempo se realizaron estudios de las velocidades iniciales, utilizando caseína como sustrato. Se observó que hasta los 5 min de reacción existía una elevada correlación. Los incrementos en las concentraciones de cisteína agregada a la mezcla de reacción aumentaron la actividad proteolítica de los extractos, lográndose la máxima actividad en presencia de cisteína 12mM. Mediante el agregado de este activador se obtuvieron valores de actividad enzimática de hasta 4 veces superiores. Se debe tener en cuenta que los extractos originales se prepararon en buffer conteniendo cisteína 5 mM, para lograr un ambiente reductor o protector en el medio y evitar la oxidación de cualquier componente estructural de la enzima. De esta manera, el agregado de cisteína tiene undoble efecto: a bajas concentraciones logra un ambiente protector y a elevadas concentraciones produce un aumento de la eficiencia catalítica. Los resultados obtenidos con el agregado de cisteína constituyen un indicio de que estas proteasas deben ser del tipo cisteínicas. Resultados similares fueron obtenidos en presencia de DTT y β mercaptoetanol.
Resultados & Discusión / Extractos Crudos 123El buffer de extracción también contuvo EDTA 5 mM, componente que se agrega corrientemente a los buffers utilizados para probar actividad proteolítica sobre caseína de extractos crudos o parcialmente purificados. La función del EDTA es secuestrar metales que puedan presentes en los extractos vegetales que aún no han podido ser removidos y que pueden interferir en la actividad de estas peptidasas.Los metales pesados pueden inhibir a las endopeptidasas cisteínicas por formación de mercáptidos (Storey & Wagner, 1986). La actividad proteolítica disminuyó en un 95% para ambas muestras cuando se agregaron iodoacetato o E-64 (inhibidores típicos de proteasas cisteínicas) luego de 15 min de incubación. Se demostró que la inhibición fue irreversible, pues la adición de cisteína no fue capaz derevertirla, tanto si se adiciona en el momento de iniciar la incubación con el ácido iodoacético o con el E 64, como después de 30 min de incubación (Fig. 1).
Figura 1. Inhibición de los EC de Araujia angustifolia y A. hortorum empleando inhibidores específicos de proteasas cisteínicas
Los
análisis
de
inactivación
con
HgCl2, inhibidor
reversible
de
endopeptidasascisteínicas por formación de mercáptidos, confirmaron la naturaleza cisteínica de las proteasas presentes en los extractos crudos. En presencia de este inhibidor se produce una inhibición total con todas las concentraciones ensayadas, que resultó revertida por el agregado de cisteína
Resultados & Discusión / Extractos Crudos 124 luego de 30 min de incubación frente al inhibidor. Si se adicionacisteína previamente al agregado del inhibidor la inhibición no tiene lugar. En consecuencia, la activación por parte de la cisteína y los resultados de inhibición indican una dependencia de la actividad de la/s enzimas de la presencia de los grupos SH- en el sitio activo. Esta conducta se demostró previamente para otras proteasas de la familia Asclepiadaceae (Lynn et al., 1980a; Abraham & Joshi,...
EXTRACTOS CRUDOS
Características generales El contenido de proteínas del extracto crudo obtenido a partir del látex de los frutos de Araujia angustifolia fue de 1,5 mg/ml y de 5,4 mg/ml para el de Araujia hortorum. Empleando las técnicas mencionadas en Materiales y Métodos se pudieron detectar varias actividades hidrolíticas en los extractoscrudos estudiados. Ambos extractos mostraron actividad proteásica, amidásica, esterásica, poligalacturonidásica y pectinmetilesterásica. Con los métodos empleados no exhibieron actividades ramnogalacturonidásica, xilanásica, metilcelulásica y carboxipeptidásica. La principal actividad catalítica observada fue la proteolítica. Para conocer el intervalo de tiempo en que se mantenía una correlación linealentre velocidad de reacción y tiempo se realizaron estudios de las velocidades iniciales, utilizando caseína como sustrato. Se observó que hasta los 5 min de reacción existía una elevada correlación. Los incrementos en las concentraciones de cisteína agregada a la mezcla de reacción aumentaron la actividad proteolítica de los extractos, lográndose la máxima actividad en presencia de cisteína 12mM. Mediante el agregado de este activador se obtuvieron valores de actividad enzimática de hasta 4 veces superiores. Se debe tener en cuenta que los extractos originales se prepararon en buffer conteniendo cisteína 5 mM, para lograr un ambiente reductor o protector en el medio y evitar la oxidación de cualquier componente estructural de la enzima. De esta manera, el agregado de cisteína tiene undoble efecto: a bajas concentraciones logra un ambiente protector y a elevadas concentraciones produce un aumento de la eficiencia catalítica. Los resultados obtenidos con el agregado de cisteína constituyen un indicio de que estas proteasas deben ser del tipo cisteínicas. Resultados similares fueron obtenidos en presencia de DTT y β mercaptoetanol.
Resultados & Discusión / Extractos Crudos 123El buffer de extracción también contuvo EDTA 5 mM, componente que se agrega corrientemente a los buffers utilizados para probar actividad proteolítica sobre caseína de extractos crudos o parcialmente purificados. La función del EDTA es secuestrar metales que puedan presentes en los extractos vegetales que aún no han podido ser removidos y que pueden interferir en la actividad de estas peptidasas.Los metales pesados pueden inhibir a las endopeptidasas cisteínicas por formación de mercáptidos (Storey & Wagner, 1986). La actividad proteolítica disminuyó en un 95% para ambas muestras cuando se agregaron iodoacetato o E-64 (inhibidores típicos de proteasas cisteínicas) luego de 15 min de incubación. Se demostró que la inhibición fue irreversible, pues la adición de cisteína no fue capaz derevertirla, tanto si se adiciona en el momento de iniciar la incubación con el ácido iodoacético o con el E 64, como después de 30 min de incubación (Fig. 1).
Figura 1. Inhibición de los EC de Araujia angustifolia y A. hortorum empleando inhibidores específicos de proteasas cisteínicas
Los
análisis
de
inactivación
con
HgCl2, inhibidor
reversible
de
endopeptidasascisteínicas por formación de mercáptidos, confirmaron la naturaleza cisteínica de las proteasas presentes en los extractos crudos. En presencia de este inhibidor se produce una inhibición total con todas las concentraciones ensayadas, que resultó revertida por el agregado de cisteína
Resultados & Discusión / Extractos Crudos 124 luego de 30 min de incubación frente al inhibidor. Si se adicionacisteína previamente al agregado del inhibidor la inhibición no tiene lugar. En consecuencia, la activación por parte de la cisteína y los resultados de inhibición indican una dependencia de la actividad de la/s enzimas de la presencia de los grupos SH- en el sitio activo. Esta conducta se demostró previamente para otras proteasas de la familia Asclepiadaceae (Lynn et al., 1980a; Abraham & Joshi,...
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