Fago t4

Guía Laboratorio de Virología     

Recuperación, Detección y Titulación de Fagos T4r Mediante el  Método de Placas de Lisis  
    Introducción     Los  bacteriófagos  T  han  sido  modelos  en  el  desarrollo  de  la  genética  moderna  y  la  biología  molecular  desde  los  años  40.  Muchos  investigadores  han  usado  los bacteriófagos y sus distintos grados de complejidad para obtener información genética  y fisiológica con experimentos relativamente simples. Los bacteriófagos T2 y T4 fueron  fundamentales  para  comprender  muchos  procesos  biológicos.  Entre  ellos,  el  reconocimiento de los ácidos nucléicos como material genético, la definición de gen por  análisis de mutación, recombinación y de función, la demostración del código genético  como  tripleta,  el descubrimiento  del  RNA  mensajero  (mRNA),  la  importancia  de  la  recombinación  en  la  replicación  del  ADN,  mecanismos  de  reparación,  restricción  y  modificación del ADN, entre otros (Millar E, et al. 2003).     Los virus T4 son colifagos de morfología binal con una copia única de ADN de doble  cadena y con una complejidad estructural extrema que consta de: una cápside, una cola contráctil, una placa basal asegurada a la parte distal de la cola y unidas a esta placa  basal:  fibras  cortas  y  pequeñas  (Figura  1).  Los  fagos  T4  pertenecen  a  la  familia  Myoviridae,  cuyos  integrantes  tienen  la  capacidad  de  infectar  Escherichia  coli  B.  El  genoma  de  este  virus  (168.903  bp)  tiene  289  ORFs  y  8  genes  de  tRNA.  Se  han  caracterizado  más de  150  genes,  de  los  cuales  sólo  62  parecen  ser  ʺesencialesʺ  (Mesyanzhinov  V,  et  al.  2004).  Los  fagos  silvestres  se  han  designado  de  acuerdo  a  la  notación Demerec y Fano (1945) por números precedidos por la letra T (para Tipo). T  se  ha  vuelto  una  designación  genérica  para  los  fagos  que  actúan  en  E.  coli  B.  Los  números  han  clasificado  los  fagos de  acuerdo  a  sus  características  serológicas  y  morfológicas y van de 1 a 7 (T1‐T7) (Abedon ST. 2000).     Los bacteriófagos T emplean una poderosa estrategia para maximizar el número de  partículas virales en una población susceptible de E. coli (Doermann AH. 1948; Hershey  AD. 1946). Esta estrategia se basa en poder controlar el tiempo en el cual ocurre la lísis, en respuesta al número de partículas virales en el medio con el objetivo de maximizar  el uso de su hospedero actual. Las células son inicialmente infectadas con una sola  partícula de fago y a 37°C con buena oxigenación, lisan de 25 a 35 minutos después de  la infección, liberando un orden de cientos de partículas por célula. Eventualmente la relación entre partículas liberadas a células no lisadas excede 1, en este momento las  células son infectadas por una partícula y ʺsuperinfectadasʺ por partículas adicionales.  Cuando el intervalo entre infección y superinfección es de 3 o más minutos, las  partículas ʺsuperinfectantesʺ ya no lisan a la misma velocidad (Doermann AF. 1948;  Abedon ST. 1992). Este fenómeno es llamado inhibición de lisis (LIN). 

 

 Figura 1. A: Micrografía electrónica del bacteriófago T4. B: Componentes estructurales  de una partícula de T4. (Adaptado de Miller E, et al. 2003)    Una  consecuencia  de  este  fenómeno  es  que  los  bacteriófagos  como  T4  forman  placas  pequeñas con halos turbios. Sin embargo, los fagos T pares (T2, T4 y T6) son capaces de  mutar y generar fagos sin LIN. El tipo silvestre (r+) es capaz de formar placas pequeñas con halos turbios en ensayos de placa, mientras que el tipo  mutante (r), forma placas  grandes  con  halos  claros.  Otra  característica  que  distingue  los  fagos  (r+)  de  los  (r),  es  que el tiempo requerido para observar la lisis en un cultivo es mayor para el mutante r.   En  esta  práctica,  se  realizará  la  recuperación  y  purificación  del  fago  T4r  mediante  la ...