Filtrac Ion

cion en gel13. Cromatografía de filtración en gel
José Luis Caballero Repullo, Juan Muñoz Blanco, Enriqueta Moyano Cañete
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

La cromatografía de filtración en gel es una técnica que permite separar moléculas en función de su tamaño molecular. La capacidadseparadora reside fundamentalmente en el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Cada gel se caracteriza por un rango de fraccionamiento que depende del tamaño de sus poros. El objetivo de esta práctica es separar una mezcla de sustancias de distinto peso molecular por medio de una cromatografía en una columna de Sephacryl S-200 HR y determinar los correspondientesparámetros que caracterizan el comportamiento cromatográfico de cada sustancia. Palabras clave: exclusión, purificación, separación. Abreviaturas empleadas. FMN: mononucleótido de flavina; TE: tampón de elución

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.1. Introducción La purificación de una sustancia de interés se hace siguiendo los criterios de separación basados en alguna propiedad física o química quediferencia al compuesto en cuestión de otros que en principio estarían ligados a él. Entre los diversos criterios de separación cabe citar: -Aquellos que fraccionan las moléculas basándose en sus tamaños, como la cromatografía de filtración en gel y la ultracentrifugación. -Los que separan las moléculas atendiendo a las diferencias en la carga eléctrica neta del compuesto, como la cromatografía deintercambio iónico y la electroforesis. -Los que se basan en la retención específica de sólo uno o varios tipos de moléculas, entre los que cabe destacar la cromatografía de afinidad. -Procedimientos de separación basados en diferencias de solubilidad. -Métodos basados en la adsorción diferencial a determinadas matrices. La cromatografía de filtración en gel, más corrientemente llamada de exclusiónmolecular, es una técnica de purificación muy extendida y apreciada debido a su sencillez y eficacia en la resolución de mezclas complejas de
1

macromoléculas. Esta técnica puede utilizarse con buenos resultados con fines analíticos (por ejemplo, para la determinación de pesos moleculares). 1. 2. Principio de la cromatografía de filtración en gel Con la cromatografía de filtración en gel seseparan moléculas en virtud de sus diferencias de tamaño. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran número de esferas porosas microscópicas. Estas esferas están constituidas por largas cadenas de polímeros unidas entre si por enlaces químicos para formar una red tridimensional. El gel, una vez hidratado, se deposita adecuadamente en una columna hueca de vidrio (Fig. 1)quedando listo para su uso.

Ent rada

de

m uest ra

Líquido que baña el gel Superficie del gel

Gel

deposit ado

Filtro poroso que retiene el

gel

Espacio muert o ocupado por relleno inert e

Salida

de

muestra

f raccionada

Figura 1. Esquema de una columna de cromatografía de filtración en gel

En el interior de una columna de cromatografía pueden distinguirsevarios volúmenes (Fig. 2): a) El volumen total (Vt), que es el volumen que ocupa el cilindro de gel hidratado. b) El volumen de vacío (Vo), o el volumen existente entre las esferas del gel. c) El volumen ocupado por las esferas del gel, que se expresa como la diferencia entre los dos volúmenes anteriores: Vt-Vo.

2

a

b

c

Vt

Vo

Vt - Vo

Figura 2. Volúmenes de una columnacromatográfica

Cuando una mezcla de moléculas de diferentes tamaños se hace pasar a través de la columna de gel, se produce la separación en virtud del siguiente principio: - Las moléculas de muy pequeño tamaño penetran en el interior de las esferas que componen el gel y, por consiguiente, no son extraídas de la columna hasta que no ha pasado a través de ella un volumen de líquido igual a su volumen...