Fisiologia

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Coloracion de Gram y Frotis

Maria Isabel Orta Rumbos
Ci 19.899.442
Asignatura: Microbiologia

Coloracion de gram.

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en 1884. Se utiliza tanto parapoder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

Recoger muestras.* Hacer el extendido en espiral.
Dejar secar a temperatura ambiente.
Fijar lamuestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 min. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-purpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la coloracion)Enjuagar con agua.
Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar 1-2 min Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, sevuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la siguiente:

El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, yforma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas, los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

Varias son las teorías emitidas paraexplicar el mecanismo de la tinción de Gram. Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las proteínas de las bacterias, Las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en soluciones alcalinas lo hacen con lasbases. De igual manera, comprobaron que la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido proteínico; estos microorganisSe denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es muy difícil obtener una imagen clara y nítida. Estefrotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y lasposibles agrupaciones de células que pudiera haber.

REALIZACIÓN DEL FROTIS

‪1.‬Colocar una pequeña gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mínima gota de agua, que resulta suficiente.
‪2.‬Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones...
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