Fluorescencia

INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA FLUORESCENCIA Al incidir radiaciones electromagnéticas de longitud de onda adecuada sobre las moléculas orgánicas se puede producir una transición desde el estado electrónico fundamental hasta un estado electrónico excitado, generalmente el primero. Si bien en una solución a temperatura ambiente la mayor parte de las moléculas suelen encontrarse en su nivelvibracional fundamental, tras la excitación radiante pueden pasar a un nivel vibracional más elevado del primer estado electrónico excitado. Los estados excitados son inestables; por tanto, existe en las moléculas una tendencia a retornar al estado electrónico fundamental. La molécula, para perder el exceso de energía absorbida y volver el estado de mínima energía y por tanto el más estable. Enfluorescencia esa energía se pierde en forma de un fotón, sin cambio en la multiplicidad del spin. La fluorescencia tiene lugar en sistemas químicos gaseosos, líquidos y sólidos tan sencillos como complejos. El tipo más sencillo es el que presentan los vapores atómicos diluidos. Por ejemplo, los electrones 3s de los átomos de sodio vaporizados pueden ser excitados al estado 3p mediante la absorción deradiación de longitudes de onda de 5.896 y 5.890 Å. Después de excitados los electrones vuelven al estado fundamental emitiendo radiación de estas dos mismas longitudes de onda en todas las direcciones. Este tipo de fluorescencia, en la cual la radiación absorbida es reemitida sin cambio de frecuencia, se conoce como radiación de resonancia o fluorescencia de resonancia. Muchas especies molecularestambién presentan fluorescencia de resonancia. Sin embargo, es mucho más frecuente encontrar bandas de fluorescencia molecular centradas en longitudes de onda más largas que la línea de resonancia. Este desplazamiento hacia longitudes de onda más largas, o menores energías se denomina desplazamiento stokes. INSTRUMENTOS PARA LA MEDIDA DE LA FLUORESCENCIA Los distintos componentes de los instrumentospara la medida de la fluorescencia son similares a los que se encuentran en los fotómetros o espectrofotómetros ultravioleta / visible. Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz, para compensar las fluctuaciones en la potencia de la fuente. El haz de la muestra pasa primero a través de un filtro o un monocromador de excitación, que transmite la radiación queprovocará la fluorescencia pero excluye o limita la radiación de la longitud de onda de la emisión fluorescente. La fluorescencia se propaga desde la muestra en todas las direcciones pero lo más conveniente es observar la que forma un ángulo recto con el haz de excitación; a otros ángulos, la dispersión producida en la disolución y en las paredes de las cubetas aumenta y se pueden cometer grandes erroresen la medida de la intensidad. La radiación emitida llega a un fotodetector después de haber pasado por un segundo filtro o monocromador que aísla la fluorescencia para su medida. El haz de referencia pasa a través de un atenuador que reduce su potencia a aproximadamente la de la radiación fluorescente (normalmente la potencia se reduce en un factor de 100 o más).Las señales procedentes delfotomultiplicador de la muestra y del de referencia se dirigen a un amplificador diferencial cuya salida se visualiza en un medidor o un registro. Algunos instrumentos de fluorescencia son de tipo nulo; esta condición se consigue con atenuadores ópticos o eléctricos. Los instrumentos más modernos utilizan un circuito divisor analógico o un sistema de adquisición de datos digital seguido del tratamientode los datos para obtener la relación entre la intensidad de la fuente de radiación. 1

La sofisticación, las características de funcionamiento y el coste de los fluorómetros y de los espectrofluorímetros difieren de unos a otros como ocurre con los correspondientes instrumentos para las medidas de absorción. Los fluorómetros son análogos a los fotómetros de absorción, en ambos se utilizan...