Fluorescencia

Fluorescencia

Fluorescencia es la propiedad que tienen algunas sustancias de absorber energía y luego emitir parte de esa energía en forma de luz.
La energía emitida en forma de luz es siempre menor a la absorbida y la diferencia entre ambas es disipada en forma de calor.
En general las sustancias fluorescentes absorben energía en forma de radiación electromagnética de onda corta (pej radiación gamma, rayos x, UV), y luego la emiten nuevamente a una longitud de onda mas larga, por ejemplo dentro del espectro visible; sin embargo existen muchas sustancias que son capaces de producir fluorescencia al recibir energía de otras fuentes, por ejemplo por la colisión de partículas como la radiación alfa, radiación beta,neutrones y hasta rayos cósmicos.
En el mecanismo de fluorescenciatípico una molécula absorbe un fotón de alta energía, sufre una excitación electrónica y algunos de sus electrones son promovidos a orbitales moleculares de mayor energía, luego estos electrones excitados decaen nuevamente a orbitales de menor energía emitiendo luz de onda mas larga en el proceso. La diferencia de energía entre los fotones absorbidos y los emitidos se disipa en forma calor por medio dediferentes mecanismos de conversión interna. Todo el proceso es muy breve, transcurre en tiempos del orden de la millonésima de segundo, por lo que puede considerarse prácticamente instantáneo. Es este tiempo tan corto lo que diferencia a la fluorescencia de otro conocido fenómeno luminoso, la fosforescencia. El mecanismo de fluorescencia también se encuentra muy relacionado con el procesodequimioluminiscencia.
Las sustancias que son capaces de emitir luz al ser excitadas por diferentes tipos de radiación se denominan fluoróforos.
Es posible obtener una una amplia variedad de colores por fluorescencia, dependiendo de la longitud de onda que emita el compuesto fluorescente.

Bioquímica y medicina
Las biomoléculas pueden marcarse con un grupo químico fluorescente (fluorocromo) medianteuna reacción química simple, lo cual permite una detección sensible y cuantitativa de la molécula. Algunos ejemplos:
* La microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares se consigue marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que aquél encuentre su antígeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios anticuerpos con diferentes fluorocromosse puede lograr la visualización de múltiples objetivos dentro de una misma imagen.
* Secuenciación automática de ADN por el método de terminación de la cadena: cada uno de los cuatro ddNTP se encuentra marcado con un fluorocromo específico, de tal forma que se generan cadenas de diferente longitud que al ser sometidas a una fuente de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cadacadena debido a la longitud de onda emitida característica de cada fluorocromo.

* Detección de ADN: el compuesto bromuro de etidio, libre de cambiar su conformación en disolución, tiene poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio se aumenta enormemente cuando se une al ADN, de tal forma que este compuesto es muy útil para visualizar la localización de fragmentos de ADN en elmétodo de electroforesis en geles de agarosa. El bromuro de etidio puede ser tóxico, por tanto una alternativa más segura es teñir con SYBR Green.
* Microarreglos
* Inmunología: los sitios de unión de un anticuerpo a un espécimen microscópico por ejemplo, pueden ser vistos, e incluso cuantificados, empleando la fluorescencia si se le ha unido previamente un grupo químico fluorescente alanticuerpo específico (IFI).
* La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformación del ADN, así mismo como de proteínas, con técnicas como latransferencia de energía de resonancia, la cual mide distancias a nivel de angstroms. Lo anterior es especialmente importante en complejos de biomoléculas múltiples.
* Es utilizada en (Citometría) de flujo para...