Fosfatasa alcalina

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30. Caracterización cinética de la fosfatasa alcalina
José Antonio Bárcena Ruiz, Concepción García Alfonso, Carmen Alicia Padilla Peña, Emilia Martínez Galisteo, Jesús Díez Dapena
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

La fosfatasa alcalina es una enzima que cataliza la hidrólisis del enlace ésterfosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosforilo a pH alcalino, lo que libera fosfato al medio. En esta práctica se van a estudiar algunos aspectos cinéticos de la fosfatasa alcalina comercial de mucosa intestinal bovina. Para ello se va a emplear un método de ensayo de la actividad de esta enzima que emplea como sustrato un éster de fosfato artificial, el p-nitrofenilfosfato, cuya hidrólisisda lugar a fosfato y a pnitrofenol. Éste último adquiere color amarillo a pH alcalino por lo que se puede cuantificar colorimétricamente a 405 nm. Se obtendrá la curva de progreso de la reacción catalizada y se determinará la velocidad inicial y la concentración de enzima. Se comprobará la dependencia de la velocidad de reacción con la concentración de enzima y se calculará gráficamente la Km dela enzima. Palabras clave: Eaddie Hofstee, Lineweaver-Burk, Unidades Internacionales de actividad enzimática, velocidad máxima. Abreviaturas empleadas. PNPP: p-nitrofenilfosfato; PNP: p-nitrofenol; UI: Unidades Internacionales de actividad enzimática.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 1.1. Cinética enzimática La cinética enzimática es la parte de la Enzimología que se ocupa del estudio de la velocidadde las reacciones catalizadas por enzimas y las causas de su variación. Los ensayos enzimáticos se emplean rutinariamente en muchos laboratorios clínicos para el diagnóstico de numerosas enfermedades, bien observando velocidades de reacción anormales o bien observando niveles enzimáticos inadecuados en el plasma u otros tejidos. Un ensayo enzimático se basa en la actuación de la enzima sobre unasustancia, llamada sustrato, catalizando su conversión en otra específica, conocida como producto. Normalmente algún elemento de los que intervienen en la reacción absorbe luz a una longitud de onda determinada, con lo que la reacción puede seguirse por colorimetría o espectrofotometría.
1

1.2. Fosfatasa alcalina La fosfatasa alcalina (Ortofosfórico monoéster fosfohidrolasa, (EC 3.1.3.1) esuna enzima ampliamente distribuida que hidroliza (3) el enlace éster (1) fosfórico entre un grupo fosfato y un radical orgánico a pH básico (pH óptimo entre 9 y 10) liberando fosfato inorgánico. Está presente en riñón, hígado, intestino y hueso. La medida de niveles anormales de fosfatasa alcalina en el suero indican la existencia de enfermedades óseas degenerativas (raquitismo, osteomalacia,hiperparatiroidismo secundario, osteosarcoma) o bien daños hepáticos. El aumento fisiológico de los niveles plasmáticos de fosfatasa alcalina se produce en animales en fase de crecimiento (se está formando tejido óseo) o en hembras gestantes (fosfatasa alcalina de la placenta). Esta enzima, también se utiliza como control de la adecuada pasterización de la leche y crema, dado que la fosfatasa alcalinase inactiva por calentamiento. 1.3. Ensayo enzimático Como sustrato de la fosfatasa alcalina utilizaremos un compuesto artificial: p-Nitrofenil-fosfato que, al poseer un resto orgánico con un grupo fosfato unido, puede ser reconocido por la enzima. El sustrato al ser hidrolizado origina un producto, el p-Nitrofenol, compuesto coloreado que en solución alcalina absorbe a una longitud de onda de 405nm, por lo que su aparición en el transcurso de la reacción (Figura 1) puede seguirse colorimétricamente. Para detener la reacción se añadirá fosfato, ya que el exceso de este producto de la reacción inhibe la actividad enzimática.

O

HO P OH

O

Fosfatasa alcalina

O
O

+
+ -

H2 O
+

+ HO P OH
OH

+

H

+

N

N
O
-

O

O

-

O

p-nitrofenil-fosfato...
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