Fosfatasa alcalina

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Purificación parcial de fosfatasa alcalina de hígado de rata. Precipitación fraccionada con sulfato de amonio.
Materiales. Hígado de rata Tampón Tris-HCL 0,1M pH 8,0 p-Nitrofenil fosfato 0.003MSulfato de amonio Reactivo de Bradford

Metodología de purificación. Se entregará un trozo de hígado de rata (anote el peso en gramos) que debe colocar en un mortero. Agregar nitrógeno líquido yproceder a su trituración. Una vez triturado vierta tampón frío en el mortero. Todos los procedimientos siguientes deben efectuarse en recipientes con hielo. 1. Usted dispone de un volumen de homogenizado dehígado de rata en tampón. 2. El homogenizado se lleva a tubos de centrífuga y se somete a 20.000g por 20 min a 4ºC. 3. Terminada la centrifugación descarte el sedimento y mantenga el sobrenadante enun recipiente con hielo. Este es el homogenizado crudo soluble. 4. Mida el volumen del sobrenadante. Guarde 1 ml para medir actividad enzimática y concentración de proteínas. 5. Agregue alsobrenadante sulfato de amonio, con agitación constante mientras agrega lentamente la sal. Este procedimiento lleva a 40% el porcentaje de saturación de sulfato de amonio en la solución. Calcule la cantidad desal a agregar a partir de la tabla anexa. 6. Deje reposar por 10 min en un recipiente con hielo. 7. Centrifugue la suspensión a 15.000g por 15 min. Separe el sedimento del sobrenadante. 8. Mida elvolumen de sobrenadante y disuelva el sedimento en un volumen de tampón igual al volumen del sobrenadante. Guarde 1 ml de sobrenadante (sobrenadante 40% sulfato de amonio) y 1 ml de sedimento disuelto (pp40% sulfato de amonio), para medir actividad enzimática y concentración de proteínas. 9. Agregue al sobrenadante sulfato de amonio con agitación constante mientras agrega lentamente la sal. Esteprocedimiento lleva a 65% el porcentaje de saturación de sulfato de amonio en la solución. Calcule la cantidad de sal a agregar a partir de la tabla anexa. 10. Deje reposar por 10 min en recipiente con...
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