Fraccionamiento celular

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FRACCIONAMIENTO CELULAR
El fraccionamiento subcelular es un conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo obtener fracciones puras o enriquecidas en un determinado componente celular, ya sea éste un orgánulo (mitocondrias, núcleos, peroxisomas, etc.) una fracción de membrana (membrana total, plasmática, dominio basolateral, dominio apical, etc.), complejos multiproteicos (citoesqueletode actina, microtúbulos, poros nucleares, etc.
FASES:
* Preanalítica: Es la obtención o preparación preliminar de la muestra hasta llegar al laboratorio
* Analítica o de aplicación de procedimientos: Aquí se toman resultados para posteriormente hacer un informe.
* Postanalítica: Aquí se reconoce el informe o se valida mediante expertos.

Todo proceso de fraccionamiento subcelulartiene dos etapas:
* Rotura de las células o tejidos donde se obtiene un lisado celular (o tisular) en el que la fracción se encuentra en condiciones adecuadas para su purificación.
* Separación de la fracción deseada del resto de componentes de la célula o del tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad (centrifugación en gradientes o centrifugacióndiferencial), la presencia de algún antígeno (cromatografía de inmunoafinidad, inmunoprecipitación, etc.).

TECNICAS DE ROTURA DE CELULAS Y TEJIDOS

El primer paso en la purificación de las proteínas y estructuras subcelulares es la rotura de los tejidos o de las células para obtener un lisado celular en el que la proteína, el complejo multiproteico o la estructura subcelular se encuentra en condicionesque permitan su aislamiento. Esto se lleva a cabo por medio de la homogenización, la cual produce la rotura de las membranas celulares, suavemente, con lo que se libera el contenido celular.
Los procedimientos de homogenización más comunes son:
La purificación de cada uno de los principales organelos subcelulares hace posible el estudio detallado de sus estructuras y funciones metabólicas.La purificación se inicia con la rotura de la pared celular, de la membrana plasmática, o de ambas. Las células deben estar suspendidas en una solución con pH y concentración de sales apropiada. Normalmente se emplea sacarosa isotónica (0,25%) o una combinación de sales similar a las de la célula.
El proceso de fraccionamiento consta principalmente de las siguientes etapas:
1.HOMOGENIZACION

       La Homogenización se trata de romper las células con la ayuda de un émbolo rotatorio que se ajusta perfectamente a las gruesas paredes de un tubo de cristal especial, el homogenizador.

Células anexas: primero se deben romper conexiones con otras células.

Células no anexas: pueden separarse teniendo en cuenta forma, densidad o características que puedan marcarse.

Haydispositivos de homogenización en los que está calibrada la separación entre el émbolo y la pared lo cual ayuda a tener un homogeneizado con un tamaño de partícula determinado, la cual consiste en el procesamiento del  tejido y de las células  con el fin de obtener una mezcla fluida en la cual estén todos los componentes celulares.
Homogenizador de Esferas
Fragmentación celular por acción delchoque de las esferas de vidrio con las células.


* Tamaño de esferas:
*  0.1 mm: Bacterias, esporas.
*  0.5 mm: Levaduras, micelio, microalgas, células animales no anexas, células tripsinizadas.
*  1.0, 2.5 mm: Cerebro, músculo, piel, hojas.

La cantidad de esferas debe ser al menos el 50% del volumen total de la biomasa-líquido.
  Homogenizador de émbolo y tuboSeparación émbolo-pared del tubo calibrada según tamaño de partícula deseado.
Los tejidos deben ser previamente picados y se suspenden en un volumen exceso de medias (4-10 veces). Fraccionamiento de tejidos animales. Preferido en preparación de organelos subcelulares de tejidos frágiles como cerebro e hígado.  (Acción suave). Permite un mejor control de la temperatura generada por la fricción. No es...
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