Fraccionamiento Celular

FRACCIONAMIENTO CELULAR EN HÍGADO DE RATÓN (Mus musculus) Y ESPINACA (Spinacia oleracea)



Resumen: El fraccionamiento celular consiste en la homogeneización de una muestra, la cual es sometida una ultra centrifugación, separando las fracciones subcelulares de acuerdo a sus propiedades. El objetivo de este estudio es comprender las técnicas de separación de células para el análisis posteriorde los componentes celulares. Existen diversos métodos para la obtención de fracciones celulares como: centrifugaciones por gradiente discontinuo de densidad, centrifugaciones diferenciales; además de diversos tipos de rotores aplicados; estos pueden ser basculantes o de ángulo fijo. La separación adecuada de organelas se obtuvo de la centrifugación en rotor basculante. La centrifugacióndiferencial proporciono fracciones con un grado de pureza aceptable, que permitió la identificación de las fracciones tanto vegetal (E1, E2, E3) como animal (P1, P2, P3). Los distintos métodos de centrifugación y las variaciones en los tipos de centrifugadoras y rotores son fundamentales para la correcta segregación de los componentes celulares.

Palabras Clave: Homogeneización, orgánulos,centrifugación, rotores, cloroplastos.

1.- Introducción

El fraccionamiento celular es usado para investigar la bioquímica y fisiología de organelos fuera del ambiente de la célula. Este método consiste en la homogeneización de una muestra, lisando tejidos membranosos, quedando los orgánulos libres y sin destruir.

En la purificación de estructuras subcelulares, la ruptura de la membrana se realizamediante equipos de homogeneización de tejidos presurizados, ó por ruptura a través de aspas giratorias. Existen otras técnicas para la ruptura o lisis de la membrana celular mediante agitadores de alta velocidad, donde la ruptura celular se da a consecuencia de la vibración aplicada, y por sonicación; donde la ruptura de la membrana celular se produce por exposición a sonidos de muy altafrecuencia. También es posible fragmentar las membranas mediante el empleo de medios hipotónicos, donde la entrada de agua en el interior celular debido a la diferencia de solutos entre esta y su medio causa su lisis o “estallido”; y lisis por medio de enzimas, donde estas degradan la membrana; entre otra técnicas1. Los buffers empleados durante el fraccionamiento celular, permiten que el medio conservecaracterísticas similares a las presentes en el interior celular, previendo así la alteración de las organelas suspendidas. Posteriormente el homogeneizado es sometido una ultra centrifugación, separando las fracciones subcelulares de acuerdo con su masa, volumen y peso específico2

La centrifugación diferencial es un método que permite la separación de los componentes celulares, sometiendo elhomogenato a altas velocidades, causando sedimentación progresiva de pequeñas partículas. En las centrifugaciones, es posible obtener: fracción nuclear; la cual contiene el núcleo, células intactas y tejido, fracción mitocondrial; en la que se pueden identificar mitocondrias y cloroplastos, fracción citoplasmática entre otras. Aunque, a pesar de que este método permite separar más rápidamenteorganelos grandes de los pequeños, tiene la desventaja de que la separación pueda ser incompleta.1

Otra técnica de fraccionamiento es la centrifugación por gradiente, la cual consiste en la separación de las partículas en función de su densidad de flotación. La muestra se mezcla con un gradiente de densidad que contiene una concentración elevada de sacarosa o cloruro de cesio. Al centrifugar cadacomponente sub-celular se desplazará hacia arriba o hacia abajo hasta que alcance una posición en la que su densidad sea igual a la de su entorno (situación de flotabilidad neutra) y ya no se desplazará más. Como consecuencia se producirán una serie de bandas discretas, las más próximas al fondo del tubo contendrán las partículas con mayor densidad de flotación. Cada uno de los métodos...