Fraccionamiento celular

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  • Publicado : 6 de octubre de 2010
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Fraccionamiento celular | | | |
 
El fraccionamiento celular es una técnica bioquímica utilizada para separar los distintos orgánulos y componentes celulares para su estudio. La técnica seinicia con la homogeneización. El tejido se tritura en un homogeneizador de manera que las células se comprimen y se libera su contenido. Lo que luego se hace con ese extracto es someterlo a diferentescentrifugaciones a diferentes velocidades y tiempos, de manera que obtenemos fracciones enriquecidas de los distintos orgánulos.
Procedimiento:
Partimos de 0,5 gramos de hígado de pollo y de unasolución madre de TRIS-HCL 1M. Necesitamos para el homogeneizado 10 ml de solución TRIS-HCl 10 mM, por lo que tomamos 10 microlitros de la solución madre y rellenamos con agua destilada hasta 10ml.
En unémbolo de potter ponemos los 0,5 gramos de hígado de pollo junto con 4 ml de solución TRIS-HCL 10mM. Machacamos hasta homogeneizar sin que quede ningún fragmento. Luego pasamos 1 ml del extracto a 3tubos eppendorf marcados con la palabra nucleo y centrifugamos a 3000 rpm durante 5 minutos.
Después de esto, decantamos el sobrenadante a 3 tubos limpios y los marcamos con la palabra mitocondrias.EL pellet que ha quedado se denomina fracción nuclear y lo resuspendemos en 250 microlitros de sacarosa-TRIS. Almacenamos esta fracción a –20ºC para ensayos posteriores. Y centrifugamos elsobrenadante restante a 10000 rpm durante 10 minutos.
Una vez acabada la centrifugación, decantamos el sobrenadante a 3 nuevos tubos eppendorf marcados con la palabra microsomas. EL pellet que nos ha quedado esla fracción mitocondrial y lo resuspendemos en 250 microlitros de solución sacarosa-TRIS y almacenamos a –20ºC. Centrifugamos el sobrenadante a 12000 rpm durante 25 minutos.
Finalizada lacentrifugación, decantamos el sobrenadante a 3 tubos eppendorf marcados con la palabra citosol y almacenamos a –20ºC. Lo que nos queda en el pellet es la fracción microsomal y la resuspendemos en 250...
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