Fraccionamiento Subcelular

TRABAJOS DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR-1 CARRERA: BIOQUIMICA

Guía N°2
FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR
Introducción Así como un tejido puede ser separado en las células que lo constituyen, con las técnicas adecuadas la célula puede separarse en los diferentes organelos y macromoléculas que la componen. Una de las técnicas más utilizadas para tal propósito es el Fraccionamiento Subcelular,que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Albert Claude y Christian de Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula basándose en su tamaño y densidad. El primer paso a seguir en un fraccionamiento subcelular es la ruptura u homogenización de la muestra.Esto se logra a través de diferentes procedimientos como sonicación (exposición a sonidos de alta frecuencia), shock osmótico, o simplemente moliendo las células en homogenizadores mecánicos. En esta etapa se rompen muchas de las membranas de la célula, incluyendo la membrana plasmática y el retículo endoplásmico, las que quedan formando pequeños fragmentos o vesículas que dan origen a la fracciónmicrosomal. El resto de los componentes celulares (núcleo, mitocondrias, cloroplastos, aparato de Golgi, lisosomas y perixosomas) permanecen intactos. Las partículas y vesículas así obtenidas conservan la mayor parte de sus propiedades bioquímicas originales y permiten el estudio de la función de cada organelo celular por separado. La suspensión de células rotas obtenidas anteriormente es llamadalisado u homogenizado, y es la que se fracciona en la segunda etapa del proceso. Se realiza a través de una serie de etapas sucesivas de centrifugación en las que los componentes de la célula se separan en un campo gravitatorio. Si dos componentes de distinta masa e igual tamaño y forma están en un mismo medio, el cuerpo de mayor masa sedimentará (se irá al fondo) a mayor velocidad debido a sumayor Peso. El peso es el producto de la masa (m) y la fuerza de gravedad (g), por tanto la fuerza de gravedad se incrementa, la velocidad de sedimentación también aumentará. Para aumentar el campo gravitatorio se usan las Centrífugas (Fig.1). Estos instrumentos consisten en rotores con cavidades para los tubos, los que se hacen girar a diferentes velocidades, de manera que a mayor velocidad elcampo gravitacional obtenido es mayor. Lo mismo ocurre a mayor distancia entre el tubo y el eje de giro del rotor. En otras palabras, el campo gravitacional generado depende directamente del radio de giro y de la velocidad de rotación. Al término de una centrifugación se pueden distinguir en el tubo dos fases. En el fondo del tubo se obtiene un sedimento o pellet, y sobre él una parte líquidallamada sobrenadante.


  Generalmente, la primera etapa de separación consiste en una centrifugación a baja velocidad a la cual sedimentan sólo las células que permanecen enteras y las partículas subcelulares más grandes, los núcleos. Así, el primer pellet obtenido corresponde a una fracción enriquecida en núcleos y el sobrenadante contiene al resto de los componentes celulares en suspensión.El sobrenadante se somete a una segunda centrifugación que se realiza a velocidades intermedias, en la que sedimentan mitocondrias, cloroplastos, lisosomas y peroxisomas. El nuevo sobrenadante se re-centrifuga a alta velocidad obteniéndose un pellet enriquecido en membrana plasmática y retículo endoplásmico (fracción microsomal). Una última centrifugación del sobrenadante anterior a velocidadesaun mayores permite sedimentar finalmente los ribosomas, dejando el sobrenadante sólo la porción soluble del citoplasma, el citosol.


  Las fracciones que se obtienen por el procedimiento anterior son fracciones enriquecidas, pero no totalmente puras de los diferentes organelos. Existen otras modalidades de centrifugación en las que se utilizan medios de mayor densidad, que se obtienen con...