Fundamentos y tipos de elisas

TÉCNICAS BÁSICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

Fundamentos y Tipos de ELISAs
El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacciónantígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
ELISA Directo.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble (“tapizado”) de antígenos específicos. Lavado paraeliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de anticuerpos marcados (“conjugados”) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antígenos, el complejo quedará solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si sedesea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
ELISA Indirecto.
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con losantígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre elque sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
Pasos generales de un ELISA.
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo.
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado enel pocillo
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del substrato
9. Unión del substrato a la enzima
10. Desarrollo del color
ELISA Sándwich“DAS” (Double Antibody Sandwich).
Consta de las siguientes etapas:
• Fijación al soporte insoluble de anticuerpos específicos del agente patógeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.
• Adición de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si está presente el agente patógeno de diagnóstico (antígeno),reaccionará específicamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antígenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados.
• Adición de anticuerpos específicos del antígeno a detectar (deben tener un epítopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antígenos añadidos conla muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
• Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea.
• Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado.
ELISA Sándwich “HADAS”.
Consta de las siguientes etapas:
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