Genética microbiana

ÍNDICE

1. Mutagénesis con 2AP: obtención de mutantes resistentes a
rifampicina en cepas de escherichia coli …………………………………….. 3

( Introducción y objetivos …………………………………………………….. 3
( Materiales y métodos ………………………………………………………… 3
( Resultados …………………………………………………………………… 4
( Discusión ……………………………………………………………………. 5

2. Mutagénesis con cepas mutadoras– transferencia por
conjugación de los genes a mutagenizar ……………………………….……. 6

( Introducción y objetivos …………………………………………………….. 6
( Materiales y métodos ………………………………………………………… 6
( Resultados …………………………………………………………………… 8
( Discusión ……………………………………………………………………. 9

3. Estudio de mutantes en el operón-lac con medios
diferenciales e indicadores…………………………………………………… 11

( Introducción y objetivos …………………………………………………….. 11
( Materiales y métodos ………………………………………………………… 11
( Resultados …………………………………………………………………… 12
( Discusión ……………………………………………………………………. 13

4. Transformación bacteriana: el sistema pGLO ……………………………… 15

( Introducción y objetivos …………………………………………………….. 15
( Materiales y métodos …………………………………………………………15
( Resultados …………………………………………………………………… 16
( Discusión ……………………………………………………………………. 17
5. MUTAGÉNESIS CON 2AP: OBTENCIÓN DE MUTANTES RESISTENTES A RIFAMPICINA EN CEPAS DE Escherichia coli

1. Introducción y objetivos:

En esta práctica se pretende mutagenizar una cepa de E.coli a partir de un análogo de base que es la 2-Aminopurina (2AP); esta molécula es análoga a laadenina, pero puede pasar de forma espontánea su grupo amino a imino, de manera que la DNA polimerasa ahora la va a reconocer como una guanina, de modo que produce transiciones de tipo AT/GC.
Estas mutaciones van a dar lugar a una pérdida de la sensibilidad de la cepa bacteriana a la rifampicina (actuando de manera que este antibiótico pierda afinidad por la RNA polimerasa, punto donde actúala rifampicina); así pues lo que se quiere obtener es una tasa de mutantes espontáneos, es decir sin tratar con 2AP; y una tasa de mutantes inducidos, es decir aquellos que han sido tratados con dicho análogo de base.

2. Materiales y métodos

A partir de una cepa de E.coli (concretamente nuestro grupo nº1 utilizó la cepa 100), previamente crecida en LB, tomamos una alícuota que inoculamosen un tubo con LB y otra que inoculamos en un tubo con LB+2AP, y crecemos a 37º O/N. A las 24 horas, a partir de los tubos inoculados el día anterior, se realizó una serie de diluciones seriadas y se sembró en 2 medios distintos: LB y LB+Rifampicina. La forma de proceder se recoge en la Figura 1.1:

Tubo LB

Tubo LB+2AP

Posteriormente estas placas se mantuvieron O/N a 37º, y al díasiguiente se hizo el recuento correspondiente de colonias.

3. Resultados:

Los resultados obtenidos para la cepa 100, que es la que se utilizó en el experimento de nuestro grupo (nº1) fueron:

▪ Tubo de LB:

- Placas de LB: Dilución 10-5 → colonias incontables.
Dilución 10-6 → 149 colonias.Dilución 10-7 → 10 colonias (no las utilizaremos).

Título de viables sin 2AP: 149 colonias x 106 x 10 = 1,49 · 109 ufc/ml
Media: 1,49 · 109 ufc/ml

- Placas de LB rifam.: 0 colonias; no hay pues mutantes espontáneos.

▪ Tubo de LB+2AP:

- Placas de LB: Dilución 10-4 → colonias incontables.Dilución 10-5 → 238 colonias.
Dilución 10-6 → 51 colonias.

Título de viables con 2AP: 238 colonias x 105 x 10 = 2,38 · 108 ufc/ml
51 colonias x 106 x 10 = 5,1 · 108 ufc/ml
Media: 3,74 · 108 ufc/ml

- Placas de LB rifam.:...