Gene targeting en plantas superiores

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1. INTRODUCCIÓN

El objetivo de la mejora genética vegetal es el de obtener nuevos y mejorados cultivares de élite. Además de las técnicas tradicionales de cruzamiento y selección, en los últimos años se han desarrollado nuevas tecnologías basadas en los avances de la biología molecular que tratan de complementar los métodos convencionales de la mejora genética de plantas, entre las que destacala técnica de transformación genética o transgénesis. En este sentido sería de crucial importancia disponer de la habilidad para modificar un gen in situ o integrar un transgén en una posición específica del genoma de una célula somática de una forma controlada vía recombinación homóloga, lo que se ha denominado gene targeting.

La recombinación homóloga (HR, homologous recombination) es elprincipal modo de integración del ADN transformante o exógeno en bacterias y eucariotas inferiores. Sin embargo, en eucariotas superiores, incluidas las plantas, el ADN introducido mediante este tipo de técnicas se integra principalmente por recombinación ilegítima; es decir, en posiciones no homólogas y en principio aleatorias dentro del genoma receptor.

1. GENE TARGETING

En losprocesos de gene targeting el fragmento integrado bien puede ser un gen inexistente previamente en el organismo o bien un fragmento homólogo a un gen endógeno, el cual se utiliza para modificar in situ el gen original. La alteración de genes en su ambiente natural es una potente herramienta con la cual estudiar la función de estos genes, y modificar genéticamente los organismos. Aunque la introducciónde genes mediante gene targeting vía recombinación homóloga es una práctica común en levaduras y células procariotas, así como en células madre (troncales o stem cells) de ratones, su eficiencia en plantas superiores no es aún suficiente como para su empleo de forma rutinaria.

La integración de las moléculas de ADN exógeno en el genoma tiene lugar como consecuencia de mecanismos de roturay reparación cromosómica. En plantas, normalmente esta integración se produce mediante una unión de extremos que es independiente de la secuencia, o bien en zonas con microhomologías, a través de un proceso de recombinación ilegítima, también conocido como NHEJ (Non-Homologous End Joining). Por el contrario, para la recombinación homóloga se necesitan grandes regiones con identidad de secuenciapara guiar el proceso de recombinación, siendo por ello una condición necesaria para alcanzar el gene targeting.

Hasta el momento, las frecuencias de gene targeting obtenido en plantas superiores han sido muy bajas, del orden de 10-5 a 10-7, independientemente del tejido transformado, la especie de planta y el método de transformación utilizado (Bray y West, 2005; Cotsaftis y Guiderdoni,2005; Iida y Terada, 2005; Kumar y col., 2006; Puchta, 2003, 2005; Puchta y Hohn, 2005; Shaked y col., 2005; Wright y col., 2005). El principal obstáculo para desarrollar una estrategia efectiva de gene targeting en plantas superiores, lo representa la alta tasa de integración ilegítima de los transgenes mediante NHEJ. A ello se añade, en el caso de cereales, el problema de la dificultad de obtenerplantas transgénicas, así como la mala regeneración de los tejidos transformados en muchos casos.

Se ha visto que la integración de transgenes por la vía de la recombinación homóloga es estimulada por la formación de roturas de la doble cadena del ADN (DSBs, Double-Strand Breaks), pero en este sentido existe la dificultad de dirigir la formación de estas roturas en un punto concreto delgenoma (Puchta y col., 1993). Por ello, el reto del gene targeting ha tomado una doble vertiente, por un lado conseguir mediante distintas estrategias que la integración ocurra preferentemente vía recombinación homóloga y no mediante NHEJ, y por otro, desarrollar las herramientas para crear roturas en la doble cadena del ADN en dianas concretas del genoma

1. ESTRATEGIAS DE GENE TARGETING...
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