Genetica inversa

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41.3 La genética inversa permite la síntesis de ácidos nucléicos a partir de una secuencia de la proteína
En este punto, hemos purificado el receptor utilizando anticuerpos monoclonales. ¿Cuál es el próximo paso en la caracterización de los receptores? Hay muchas posibles respuestas a la pregunta, una muy común es aislar el ADN que codifica para el receptor. Estas son "bibliotecas" de secuenciasde ADN en las que se pueden buscar secuencias correspondientes al receptor. Por ejemplo, un ADN complementario (ADNc) la colección es una colección de secuencias de ADN que representa todos los ARNm expresadas por una célula. En esencia, el ADN complementario muestra una copia del ARNm expresadas por la célula. La enzima transcriptasa inversa del mRNA utiliza como plantilla para hacer un ADNcomplementario, o copiar. Si somos capaces de aislar el cDNA para el receptor de estrógeno, que puede insertar el ADN en bacterias, y la bacteria produce el receptor de estrógeno para nuestros experimentos. ¿Cómo podemos encontrar el receptor de estrógeno en la biblioteca de cDNA? Podemos utilizar nuestro receptor de estrógeno purificado para generar una sonda que nos permitirá identificar lassecuencias de ADN en la biblioteca que corresponden, he aquí el receptor de estrógeno.
Secuencia de la proteína es una guía de información del ácido nucléico
El capítulo 40 examina las técnicas utilizadas para secuenciar una proteína completa. Para buscar en las bibliotecas de ADN, necesitamos una sonda-un producto químico de algún tipo que reconocen secuencias de ADN que corresponden a los receptoresde estrógenos, para generar sondas para buscar el gen del receptor de estrógeno en una biblioteca de ADNc, tenemos que saber sólo una parte de la estructura primaria del receptor. Conociendo la estructura primaria de una proteína se permite el uso de la genética inversa - la generación de secuencias de ADN que corresponden a una parte de la secuencia de aminoácidos en la base del código genético.Estas secuencias de ADN se pueden utilizar como sondas para aislar el gen que codifica la proteína o el cDNA correspondiente al ARNm.
Usando el receptor purificado como material de partida, podemos utilizar el procedimiento de la degradación de Edman (p. 631) para determinar la secuencia de aminoácidos de una parte del receptor. Con esta información y una copia del código genético (p. 589) en lamano, podemos convertir la información de secuencia de proteínas en ácido nucleico de información de secuencia y luego en una sonda de ADN.
Sondas de ADN pueden ser sintetizadas por los métodos automatizados
Cadenas de ADN pueden ser sintetizados por la adición secuencial de monómeros activados a una cadena en crecimiento que está vinculado a un soporte insoluble. Los monómeros activados estánprotonados desoxirribonucleósidos 3'-phosphorarmidites en los que todos menos uno de los grupos reactivos de los nucleótidos están protegidos por la unión temporal de grupos reactivos.
En la etapa I, el átomo de fósforo 3 'de esta unidad de entrada se une a la cadena en crecimiento para formar un triéster fosfito (Figute 41, 11). En el paso 2, el triéster fosfito se oxida por el yodo paraestabilizar la relación nueva. En el paso 3, el grupo protector de mí grupo 5'-OH de la cadena en crecimiento se elimina mediante la adición de ácido dicloroacético. La cadena de ADN está alargado en una unidad y listo para otro ciclo de adición. Cada ciclo dura sólo lleva unos minutos y por lo general se alarga más de un 99% de las cadenas.
La capacidad de sintetizar con rapidez las cadenas de ADN decualquier secuencia seleccionada abre muchas vías de experimentación, por ejemplo, un oligonucleótido sintetizado marcado en un extremo con 32P o una etiqueta fluorescente se puede utilizar para buscar una secuencia complementaria de una colección de secuencias de ADN. En nuestro experimento, vamos a hacer una sonda de ADN radioactiva que corresponde a una parte de la estructura primaria del...
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