Genetica

Solo disponible en BuenasTareas
  • Páginas : 5 (1018 palabras )
  • Descarga(s) : 0
  • Publicado : 16 de agosto de 2012
Leer documento completo
Vista previa del texto
Tecnicas de Analisas Molecular
PCR cuantitativo en tiempo real



Índice
* Introducción o principio de la técnica 3
* Optimización de PCR en tiempo real 4
* Aplicación de la técnica (utilidad en la medicina) 5-6
* Bibliografía7

En todos los organismos vivos las células regulan sus actividades mediante la activación o desactivación de la expresión de sus genes. La expresión genética es generalmente proporcional al número de copias de ARN mensajero (ARNm) de un gen determinado. Este es un hecho crucial cuando se trata de identificar la presencia de productos celulares específicos ya que el ARNm estraducido en los ribosomas para formar proteínas. Por lo tanto es posible obtener datos relativos a la producción de elementos biológicos si la expresión de los genes de una célula es conocida Con el fin de abordar esta premisa, una técnica conocida como northern blotting ha sido generalmente utilizada. En este método ARN purificado es separado por electroforesis en gel de agarosa y luegoidentificado con sondas de ADN específicas (Smith & Old, 1993). Aunque esta técnica se sigue utilizando para investigar la expresión genética celular su principal desventaja es la exigencia de cantidades relativamente grandes de ARN, impidiendo su uso cuando las cantidades de ARNm son limitadas Para superar esta limitación se ha desarrollado la técnica de PCR en tiempo real, también llamada PCRcuantitativa en tiempo real. Esta técnica está basada en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) y se usa para amplificar y al mismo tiempo cuantificar moléculas de ADN o ADN complementario (ADNc) específicas y así acceder a datos fiables y precisos sobre la expresión genética de las células en estudio .La PCR en tiempo real puede generar amplicones muy pequeños (desde 60 pb) lo que la hace idealpara la detección de cambios cuantitativos en la expresión génica durante el curso de alteraciones celulares patológicas o experimentales, así como para la cuantificación de niveles de ARNm en muestras de tejidos con ARN parcialmente degradado Una característica importante de PCR en tiempo real es su amplio rango dinámico. Esto implica que una amplia gama de ratios en los genes a estudiarsey en los genes normalizadores puede analizarse con similar sensibilidad y especificidad. En esta prueba el producto de la PCR se mide al final de cada ciclo. Los datos pueden ser analizados mediante un software informático y el número de copias de ARNm o la expresión génica relativa entre varias muestras puede calcularse.
Comúnmente se emplean dos estrategias para llevar a cabo la cuantificaciónde la expresión genética con PCR en tiempo real. Estas estrategias son: cuantificación absoluta y cuantificación relativa de la PCR en tiempo real.
Optimización de PCR en tiempo real
Para obtener resultados confiables en las pruebas realizadas con la PCR en tiempo real es necesario optimizar la reacción en el laboratorio. La optimización consiste en hacer que las variaciones normales de laprueba no causen efectos importantes en los valores Ct y que tengan un impacto mínimo en la cantidad de fluorescencia observada. Los criterios más importantes para la optimización son especificidad, sensibilidad, eficiencia y reproducibilidad de la PCR en tiempo real.
Los factores que deben ser optimizados son las mezclas maestras de reactivos, la concentración de los primers, concentraciónde los marcadores fluorescentes y la concentración de la muestra. Las mejores concentraciones de reactivos y condiciones de la PCR son aquellas en las que se observa resultados óptimos en términos de la curva de fusión y de la eficiencia de la amplificación en reacciones llevadas a cabo con controles positivos o calibradores ,También es útil realizar electroforesis en gel de agarosa cuando se...
tracking img