Genomica

Análisis mutacional del gen
Homeobox de segmento muscular
1 (MSX1) en chilenos con fisuras
orales

La fisura de labio con o sin fisura palatina
(FL/P), y paladar fisurado aislado (FPA) no
sindrómicos, son defectos comunes y de etiología
diversa. Ocurren en 1/690 nacimientos en poblaciones
sudamericanas. La población chilena ha
sido intensamente estudiada en cuanto a las fisuras.
Loscálculos de riesgo de recurrencia y análisis de
segregación compleja para FL/P apoyan la hipótesis
de genes mayores involucrados en la susceptibilidad
de FL/P y FPA, en Chile. Estudios previos
han investigado posibles asociaciones entre FL/P y
MSX1, TGFA (transforming growth factor alpha),
TGFB3 (transforming growth factor beta 3), y
marcadores para microsatélites ubicados en 4q, 6p,
17q y19q.
MSX1 ha sido propuesto como un candidato
especialmente poderoso, basado en el fenotipo
del ratón knockout (con ausencia del gen).
Estudios de asociación de MSX1 con FL/P y FPA
apoyan, adicionalmente, un rol de MSX1 en
fisuras no sindrómicas. Un reporte en
una familia holandesa con una mutación sin
sentido en posición 105 en MSX1, que segrega en
una forma autosómica dominante parafisura y
agenesia dental, sugiere que, particularmente en
casos familiares, pueden identificarse mutaciones
en MSX1. Más recientemente, un tamizaje poblacional
para mutaciones en MSX1 en 917 individuos
fisurados, encontró mutaciones potencialmente etiológicas en 16, incluyendo mutaciones
sin sentido en aminoácidos conservados
y mutaciones puntuales en regiones conservadas
no identificadasen algunos de 500 individuos
controles secuenciados en este estudio.
Buscamos mutaciones en MSX1 en un grupo de
pacientes con fisuras orales, para determinar si
mutaciones en MSX1 pueden ser etiológicas (como
aquella descrita en la familia holandesa) en una
parte sustancial de casos chilenos con fisura de labio
y paladar.

MATERIAL Y MÉTODO

Fueron colectadas muestras de mucosa oraltomadas
con un hisopo especialmente diseñado (Cyto-
Soft Brush CP-5B) de 45 pacientes afectados y sus
padres en la Fundación «Dr. Alfredo Gantz Mann»
y la Sección Genética del Hospital Clínico Universidad
de Chile, desde noviembre de 2000 hasta diciembre de 2001. Este proyecto tuvo la aprobación
institucional local del Comité de Revisión y
consentimiento informado de todos los sujetos.
ElADN fue extraído de acuerdo a protocolos
publicados en el Craniofacial Anomalies Research
Center, University of Iowa. Se realizaron
PCRs en 10-25 l volúmenes conteniendo 10-20
ng ADN/l; 200 M cada uno de dATP, dCTP,
dGTP y dTTP; 1,5 mM MgCl2; 10 mM Tris/HCl pH
8,3; 50 mM KCl; 0,001% (w/v) gelatina; 0,25-1,0
M de cada partidor; y 0,01-0,02 unidades Taq
polymerasa/l. A continuación delensamblaje, las
reacciones fueron cubiertas con 50 l de aceite
mineral.
Siguiendo la amplificación del ADN, ocho
pares de partidores traslapados, abarcando los dos
exones de MSX1, fueron amplificados y revisados
en todas las muestras de los casos y sus padres, en
búsqueda de polimorfismos de conformación de
única hebra (SSCPs). Además, también se examinó
una sección de 400 pares de basesdel intrón
con 80% de homología de nucleótidos del ratón.
Se realizó secuenciamiento directo de la
región intrónica y de la primera serie del partidor
del exón 1 y 2. No fueron posibles más secuenciaciones
debido a limitaciones en la calidad de la
muestra. Partidores de PCR no incorporados y
trifosfatos de deoxinucleótidos en la muestra
fueron eliminados antes de la secuenciación, poraislamiento de la banda deseada en un gel de
agarosa al 2% acoplado a una columna de
purificación. El ciclo de secuenciación fue realizado
en una reacción de 20 ul, usando 40 ul de
reactivo de secuenciación ABI Big Dye Terminator
(versión 2 o versión 3), 1 ul de 5 uM de partidor
de secuenciación, 1 ul DMSO, 4 ul de 2,5 X Buffer,
y 2,5 ng/100 bp de templado de ADN. Siguiendo
el paso de...