Identificacion con tecnicas citoquimicas o inmunocitoquimicas

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CITOQUIMICA
Para identificar las células Clara, NBT tinción se realizó. Las células se colocará en las diapositivas de cristal con un Shandon citocentrifugado(5 min, 500 rpm). Después de secado al aire, las células fueron fija en 10% de fosfato formalina tamponada durante 30 segundos. Las láminas fueron incubadas en unasolución fresca de 0,1% NBT
(Sigma, N-6876) y 0,1% NADPH (Sigma, N1630) en PBS con 25 mM HEPES durante 10 minutos a 37 ° C. Luego se lavaron las diapositivasen agua destilada y contrastados con verde de metilo. Sólo las células Clara mancha púrpura oscuro (véase la disposición adicional 1 panel A). La fijación enformol breve es necesaria, ya
algunas células no-Clara demostrar débil coloración púrpura.

INMUNOCITOQUIMICA
Inmunotinción para marcadores específicos de lacélula
anticuerpos comerciales y las concentraciones fueron las siguientes: 1:1000 de ratón anti-pan mezcla citoqueratina (C2 2, Sigma, St. Louis), 1:5000 de conejoanti-pro-SP-C (Chemicon, Temecula, CA), 1:500 ratón anti-β-tubulina-IV (Biogenex, SanRamon, CA) y 1:200 ratón anti-vimentina (Sigma, St. Louis, MO). Burro deanticuerpos anti-CC10 fue un regalo del Dr. G Singh (Pittsburgh VA Medical Center) y se utiliza en 1:10.000. IgG de conejo y de ratón para controlar las uniones noespecíficas fueron de Biocare Médica (Concord, CA). FITC y secundaria de anticuerpos TRITC conjugado se utiliza en una concentración 1:200 (Laboratorios Jackson deBar Harbor, ME). Montaje de los medios de comunicación que contiene DAPI (Vector Labs, Burlingame, CA) se utilizó para la tinción de inmunofluorescencia.
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