Ingenieria Genetica

Cebador B TCGACGCT AGCCGCGA TCGGCGCT AGCTGCGA Cebador C

TCGGCGCT AGCCGCGA

TCGACGCT AGCTGCGA

Secuencia EcoRI Secuencia BamHI

EcoRI

BamHI

Sitio BamHISitio EcoRI

Añadir sitios de restricción a los extremos de fragmentos de ADN

dNTP dCTP: DIG (Digoxigenina)

PCR

Desnaturalización

Otra posibilidad es marcar loscebadores

Marcaje de sondas oligonucleotídicas por PCR

DIFERENCIAS ENTRE GENOTECA GENÓMICA GENOTECA DE ADNc
1

2

3

1

2
Pre-ARNm ARNm

1

2

3
AAA AAART1ªc

1

2
AAA AAA

AAA TTT RT-PCR RT12ªc TTT AAA Eslabones

AAA TTT

: Sitio de restricción

TTT AAA

PCR

3 CLONES CON ADN GENÓMICO

2 CLONES CON ADNcEjemplo de RT-PCR.
Análisis de la expresión del mRNA del gen porcino NRAMP1

AA..AA AA..AA

ARNm_2,2 Kb ARNm_1,5 Kb

AA..AA AA..AA RT ARNm

ARNm

ADN1c_2,2 Kb 307pb ADN1c_1,5 Kb PCR con primers específicos a ambos ARNm producto de PCR 307 pb

> 307 pb PCR alelo- específica

Ejemplo de rt-PCR cuantitativa (a tiempo real).Análisis de la expresión de dos mRNAs del gen porcino CD51 por PCR alelo-específica
A2.5F AATTAAGATCTCAAATTCACAGA

Cebadores marcados con fluoróforosCCCTTTGAGAATTAAG…………………………………….ACTGAA 14F A14R

A2.5F: 5’ AATTAAGATCTCAAATTCACAGA 3’ 14F: 5’ CCCTTTGAGAATTAAGACTGAA 3’ A14R: 5’ TACAGGATTGCACCTCTTTC 3’ Tª hibridación: 50ºC

Se mide mediante un fluorímetro el marcajeincorporado a los productos de PCR en relación con el ciclo de PCR.
Individuo 8

Individuo 15
Fluorescencia Fluorescencia

14F/A14R A2.5F/A14R

14F/A14R A2.5F/A14RCiclos

Ciclos

14/14

¿Genotipo del individuo 15?

2,5/14 2,5/2,5

¿Genotipo del individuo 8? 14/2.5 ¿Qué ARNm es más abundante? 2.5