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  • Publicado : 9 de febrero de 2011
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Materiales y Métodos

Se transfirió el cultivo de E. coli a un tubo eppendorf, luego se centrifugue por 30 segundos y se removió el sobrenadante. A la mezcla se le añadió 200μl de la solución de resuspensión, y se realizo vortex hasta que el pellet de células se re suspendió. Se añadió 250μl de la solución de lisis, luego se mezclo por inversión 10 veces y se le añadió 250μl de la solución deneutralización, se mezclo por inversión y centrifugo por 5 minutos. Luego se hizo una purificación por columna, insertando a la columna un tubo de lavado de 2ml. Luego se agito la matriz Quantum Prephasta que se completo la re suspendida, se transfirió el sobrenadante a la columna de spin y se le añadía 200μl de la matriz, luego se mezclo por pipeteo, luego se centrifugo por 30 segundos para queel fluido pase por la columna, se removió la columna y se descarto el filtrado, luego se remplazo la columna. Luego se añadió 500μl del buffer de lavado y se centrifugue por 30 segundos, se descartoel filtrado, y se le añadió 500μl del buffer de lavado, se centrifugo por 2 minutos para remover el buffer de lavado, se removió la columna y se paso a un tubo limpio, luego se añadió 100μl de agua a70°C y se centrifugo por 1 minuto. Paso seguido se realizo una PCR la cual consistió en una preparación en la que la mezcla de reacción o “Máster Mix”, mediante la mezcla de los reactivos en lasconcentraciones dadas en la tabla 1 en un tubo eppendorf de 0.5ml.
REACTIVO | CANTIDAD (µL) |
BUFFER 10X | 2,5 |
MgCl2 50mM | 1,5 |
dNTPs 0.2mM | 0,2 |
Primer Fw 10uM | 0,5 |
Primer Rv10uM | 0,5 |
Agua ultra pura | 17,3 |
Taq Polimerasa 5U | 0,5 |
ADN | 2 |
Volumen final | 25 |

Se mezclo la reacción de PCR por vortex muy suavemente, sin que se generara burbuja y luegode un pulso en la micro centrífuga se agrego 40μL de aceite mineral grado PCR.
Seguido a esto se paso 23µl a cada uno de los eppendorf de 0.25ml, agregando en el tubo de control positivo 2µl de...
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