Invertasa

31. Extracción y ensayo de la actividad invertasa de levadura de panadería
Manuel Tena Aldave, Jesús V. Jorrín Novo
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba

RESUMEN

En la presente práctica se llevará a cabo la extracción y ensayo de la actividad invertasa de levadura de panadería, utilizando como material departida un preparado liofilizado de levadura comercializado por la casa Sigma. La velocidad de reacción se determinará analizando la cantidad de azúcares reductores formados (D-glucosa + D-fructosa, expresadas como equivalentes de glucosa) producida por unidad de tiempo y la actividad enzimática se expresará como actividad específica (p.e. µkat mg-1 de proteína). A tal fin, la cantidad de azúcaresreductores se determinará colorimétricamente por el método del ácido dinitrosalicílico, y la cantidad de proteína presente en el extracto enzimático se analizará por el método de Bradford. Eventualmente se considerará un protocolo de purificación parcial de la actividad extraída, mediante precipitación con sulfato amónico. Palabras clave: azúcar invertido, β-D-fructofuranosidasa; Saccharomycescerevisiae. Abreviaturas empleadas: BSA, seroalbúmina bovina; DNS, ácido 3,5dinitrosalicílico.

1. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS La invertasa (β-D-fructofuranosidasa, β-D-fructofuranósido fructohidrolasa, EC 3.2.1.26), cataliza la hidrólisis de restos terminales no reductores β-Dfructofuranosídicos de fructofuranósidos. Entre los sustratos sobre los que actúa el más significado es, sin duda, lasacarosa, de ahí que el enzima se designe con el nombre de sacarasa. La denominación trivial de invertasa, con la que también se conoce, hace referencia al hecho de que los productos de la reacción son conocidos desde antiguo como “azúcar invertido” ya que mientras la sacarosa es dextrorrotatoria, la mezcla equimolecular de glucosa y fructosa que resulta de su hidrólisis es levorrotatoria, por lo que enel proceso se origina un cambio de signo (de positivo a negativo) del valor de rotación óptica. Sacarosa ([α]D= +66,5º) + H2O → D-glucosa ([α]D= +52,5º) + D-fructosa ([α]D= -92º) La invertasa es un enzima ampliamente distribuido, estando presente tanto en microorganismos como en animales y vegetales, jugando un papel
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importante en el catabolismo de fructanos y más específicamente en el de lasacarosa, en especial en aquellos organismos en los que dichos azúcares son utilizados como fuente de carbono y energía. El estudio de la actividad invertasa presenta un gran interés tanto desde un punto de vista académico como de investigación aplicada, siendo uno de los enzimas más conocidos. A modo de ejemplo podemos referir que la invertasa fue el primer enzima cuya cinética se estudió enprofundidad (estudios clásicos de Michaelis-Menten) y que fue utilizado industrialmente. Para la determinación de la actividad invertasa se utilizará un ensayo indirecto en el que los productos de reacción serán detectados espectrofotométricamente tras su conversión en derivados coloreados. En concreto, la extensión de la hidrólisis enzimática de sacarosa (azúcar no reductor) en glucosa más fructosa(azúcares reductores) se valorará mediante uno de los diversos métodos existentes para la estimación de azúcares reductores. Nos referimos exactamente al método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), el cual se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por la glucosa u otro azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo ladrillo) (Chaplin, 1986), cuya presencia puededetectarse por lectura de la Absorbancia en la zona de 540-570 nm.

Ácido 3,5-dinitrosalicílico (amarillo)

D-Glucosa

Ácido 3-amino-5-nitro salicílico (rojo)

Ácido D-glucónico

En la presente Práctica aplicaremos el método DNS a una gama de soluciones patrón de glucosa, al objeto de obtener la correspondiente curva de calibrado que, posteriormente, se utilizará bien directamente, o...