Laboratorio Electroferisis

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD
Practicas laboratorio de biotecnología

Practica 1.

Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE)

La electroforesis en gel de poliacrilamida con sodio dodecilo sulfato (SDS-PAGE) es un método económico, reproducible y rápido para cuantificar, comparar y caracterizar proteínas. Este método de separación deproteínas se basa en sus pesos moleculares (Laemmli, 1970).
Las proteínas pueden ser desnaturalizadas por detergentes iónicos fuertemente positivos o negativos. El detergente aniónico sodio dodecilo sulfato (SDS). El SDS en la concentración adecuada se une a la mayoría de las proteínas en una relación peso/peso constante (1.4 g de SDS/ g proteína). La carga aportada por el SDS es proporcional alpeso molecular de la proteína y todos los complejos SDS-proteína tendrán la misma densidad de carga. Además, el SDS al unirse a las proteínas mediante interacciones hidrofóbicas, las desnaturaliza (elimina sus estructuras secundaria, terciaria y cuaternaria). Para lograr la completa desnaturalización de la muestra se debe incluir un agente reductor como el 2-mercaptoetanol y un tratamientotérmico a ebullición durante unos minutos. Estos agentes reducen los puentes disulfuro de las proteínas.
La electroforesis en condiciones no desnaturalizantes (Nativa-PAGE) una proteína en su estructura nativa tendrá una determinada relación carga – radio y migrará en un campo eléctrico a una velocidad proporcional a esa relación. Si el medio en que se realiza la electroforesis es un gel contamaño de poro adecuado, se debe tener en cuenta la relación carga - radio y el efecto tamiz aportado por el gel. Las proteínas poseen una carga neta a valores de pH diferentes de su punto isoeléctrico (PI) en el cual la carga neta de la molécula es nula. La forma de la proteína dependerá de cómo se pliegue la cadena polipeptídica (estructuras secundaria y terciaria) y su tamaño molecular. Bajocondiciones experimentales (pH, fuerza iónica, características del gel, voltaje, temperatura, tiempo de corrida) se podrán separa moléculas con diferente relación carga - radio.
Este tipo de electroforesis, al no desnaturalizar la muestra, permite realizar ensayos biológicos posteriores a la separación, como la actividad enzimática sobre el gel. La electroforesis (nativa-PAGE) separa proteínasde acuerdo a su tamaño molecular y propiedades de carga. Mientras el tamaño de poro de acrilamida sirve como tamiz molecular.

1. Equipos

Para la realización de la electroforesis se requieren los siguientes equipos

Tabla 1. Equipos y reactivos necesarios en la práctica
|Equipo |
|Cámara de electroforesis Bio-RadMini Preotean III |
|Fuente de poder (capacidad 300 V, 400 mA) |
|Beaker con agua para ebullición (92 ºC) |
|Flotador para microtubos |
|Centrífuga eppendorf |
|Contenedores de plástico o devidrio (12x16x3 cm) |
|Tubos eppendorf |
|Vortex |
|Reactivos |
|Acrilamida |
|Bis-acrilamida(N.N´-metilenobisacrilamida) |
|Tris (2-hidroximetil-2-metil-1,3 propanodiol) |
|Sódio dodecilo sulfato (SDS) |
|TEMED (N,N,N´,N´-tetrametileno-etilenodiamina) |
|Persulfato de amonio (PSA) |
|2-mercaptoetanol...