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Universidad Autónoma de Coahuila
Facultad de Ciencias Químicas

Laboratorio de Inmunología II
Dra. María Guadalupe de la Cruz Galicia

Practica:
Prueba de ELISA

Equipo #3:
Jesús Francisco Álvarez Escareño
Alba Berenice Alvarado Cepeda
Laura Janet Valdés Calvillo
Rosario Estrada Mendoza
Lilia Mariana López Alanis

28 de noviembre de 2011
Practica:
Prueba de ELISA
Objetivo:Conocer los principios en los que se basa la prueba de ELISA y familiarice con el equipo utilizado para su elaboración; así como la importancia de este tipo de pruebas y su aplicación en el ámbito de la medicina.

Introducción:
El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica comoenzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al interactuar la enzima producirá una reacción indicada por un color apreciable simple vista o cuantificable mediante eluso de un espectrofotómetro o un colorímetro.
Se han ensayado numerosas fases sólidas, desde los tubos de cristal empleados en los orígenes de la técnica, hasta microplacas actuales de 96 pocillos, las cuales están elaboradas de plástico tratado para aumentar su capacidad de absorción de moléculas y con fondos de ópticamente claros para poder realizar las medidas de densidad óptica eninstrumentos específicos, como lo son espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se han desarrollando dispositivos de mayor capacidad con hasta 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de “screening” masivo de los sistemas robotizados.
Los lectores ELISA son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos dela placa, y a diferencia de un espectrofotómetro convencional, disponen de sistemas de filtros que sólo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda que corresponden a las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.
Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:
1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima(peroxidasa, fosfatasa alcalina). El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sándwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de antígeno.
2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.
3.Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpoprimario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.
4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos seañade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría
Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA, la versión más común es el ensayo sándwich.
* Ensayo directo: (Ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones que se sospecha contienen el antígeno. Se...
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