Medicina

C a p í t u l o 4
Herramientas utilizadas por la genética molecular humana
Uno de los principales objetivos de la genetica medica moderna
es el de caracterizar la base molecular de las mutaciones que
provocan enfermedades genicas y utilizar esa informacion
para mejorar los metodos de diagnostico y tratamiento.
ANÁLISIS DE SECUENCIAS INDIVIDUALES
DE DNA Y RNA
Los genetistas molecularesse enfrentan a dos obstaculos fundamentales para llevar a cabo sus investigaciones sobre la base molecular de las enfermedades genicas. El primero es obtener una cantidad sufi ciente del DNA o RNA de interes que va a ser analizado.
El segundo obstaculo se refi ere al aislamiento de la secuencia de interes respecto a todo el resto de segmentos de DNA y moleculas de mRNA presentes en la celula. Laclonación molecular y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) representan revoluciones tecnológicas que han resuelto el problema de la obtencion del DNA y el RNA en cantidades y con un grado de pureza sufi -cientes como para que sea posible su analisis detallado.


Clonación molecular
El objetivo de la clonacion molecular es aislar un gen o cualquier otrasecuencia concreta de DNA y amplifi carlo en cantidades suficientes que permitan su estudio. Dado que cada microorganismo individual de una colonia procede de una unica celula original y contiene el mismo segmento identico transferido de DNA, se denomina clon; por su parte, todo el proceso de generacion de grandes cantidades de la secuencia de interes se denomina clonacion molecular.
Enzimas derestricción
Uno de los avances clave en el desarrollo de la clonación molecular fue el descubrimiento, al inicio de los anos setenta, de las endonucleasas de restricción bacterianas. denominadas enzimas de restriccion), enzimas que reconocen secuencias de doble cadena especifi cas en el DNA y las escinden a nivel de los elementos fosfodiester de la doble helice del DNA en el lugar de reconocimiento ocerca de este.
En la actualidad se conocen mas de 3.500 enzimas de restriccion, cada una de las cuales posee su propio sitio de reconocimiento constituido generalmente por cuatro o seis pares de bases, aunque algunas tienen sitios de reconocimiento de mayor tamano. Las secuencias son generalmente palíndromos, lo que quiere decir que la secuencia de bases del sitio de reconocimiento es la misma enambas cadenas cuando se lee en direccion 5’ a 3’. Por ejemplo, la enzima de restricción EcoRI reconoce la secuencia especifi ca de seis bases 5’-GAATTC-3’ alli donde la encuentra en una molecula de DNA de doble cadena.

La digestion de una molecula de DNA con una enzima de restriccion determinada fragmenta el DNA en un conjunto de fragmentos caracteristico y reproducible, que refleja lafrecuencia y la localizacion de los lugares de corte especificos. Por ejemplo, la enzima EcoRI rompe especifi camente el DNA bicatenario en la secuencia de seis bases 5’-GAATTC-3’.
Vectores
Un vector es una molecula de DNA que puede replicarse de manera autonoma en un huesped, como las celulas de levadura o bacterias, y que posteriormente puede ser aislado en forma pura para ser analizado. Tras lainsercion de un fragmento de DNA humano en un vector por accion de la DNA ligasa, la nueva molecula que resulta puede ser introducida en un huesped bacteriano para la propagacion del fragmento insertado junto con la molecula vector. Los vectores que se replican pueden formar un gran numero de copias por celula y los huespedes bacterianos pueden cultivarse de forma indefi nida en el laboratorio, por loque se pueden obtener grandes cantidades de las secuencias del DNA insertado.
Plásmidos
Los plasmidos son moleculas naturales de DNA circular de doble cadena presentes en bacterias y levaduras, y que se mantienen separados y se replican de forma independiente de los cromosomas del propio microorganismo. Los plasmidos utilizados como vectores derivan de moleculas naturales que se descubrieron...