metodo de lowry

INFORME DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

CQU-310











Determinación de proteínas BSA
Por el método Lowry















Sección : CQU 310 – 611 (NRC-2666)

Nombre profesores :

Fecha : 25 de Agosto de 2013


INTRODUCCIÓN

Espectroscopia. Es una técnica instrumental para poder determinar la composición cualitativa y cuantitativa de una muestra,mediante la utilización de patrones o espectros conocidos de otras muestras. El análisis espectral permite detectar la absorción o emisión de radiación electromagnética de ciertas energías, y relacionar estas energías con los niveles de energía implicados en una transición cuántica.
Ley de Beer-Lambert La Absorbancia de una especie en solución homogénea es directamente proporcional a su actividadóptica, longitud del paso óptico y su concentración. Es una relación empírica que relaciona la absorción de luz con las propiedades del material atravesado.

Métodos de cuantificación de proteínas :

-método de Lowry
-Método de Biuret
-Método Bradford
-Método del ácido Bicinconinico

Método de lowry: es un método colorimétrico de valoración cuantitativa de las proteínas bajo condicionesalcalinas Cu++ forma un complejo con los enlaces peptidicos de las proteínas y se reduce a Cu+. El Cu+ así como los grupos R de tirosina, triptófano y cisteína reaccionan con el reactivo de folin. Este reactivo reacciona primero produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de molibdeno/tungsteno esta reacción ocurre en un medio acido.
El color azul, es determinado a 650nm, este esun método muy sensible, po lo que permite trabajar con soluciones muy diluidas de proteínas (0.02-0.5mg proteína/ml)

Tiene la ventaja de ser extremadamente sensible, capaz de detectar cantidades del orden de 10 microgramos de proteína; su inconveniente principal es que al evaluar, los fenoles presentes en la proteína (esencialmente residuos de tiroxina), la intensidad del color resultantevaría entre las distintas proteínas. Pero cuando tratamos con mezclas biológicas complejas, podemos perfectamente calibrar el método con alguna proteína comercial, como es la seroalbumina bovina

La reacción que tiene lugar en el método el Lowry Se desarrolla en las siguientes fases:

1.-Reacción previa de la proteína en medio alcalino con iones Cu2+, en presencia de tartrato para evitar laprecipitación. Es esencialmente idéntica a la reacción del Biuret, formándose un complejo de coordinación entre el cobre y el nitrógeno peptídico.


2.-Reacción con el reactivo de Folin-Ciocalteau para fenoles (ácido fosfomolibdotungstico), que se reduce por medio de los grupos fenol (y en
menor medida imidazol e indol) presentes en la proteína a un complejo de
color azul oscuro, que se midecolorimétricamente. El complejo coloreado,
cuya composición es desconocida, presenta dos máximos de absorción a
las longitudes de onda de 560 y 680 nm. La elección de una u otra depende de la concentración proteica de la muestra estudiada. Dado que este método da resultados variables se requiere una curva de calibración que se hace a partir de seroalbúmina bovina.



OBJETIVOS

Aprenderel manejo de espectrofotómetro y su aplicación en los métodos colorimétricos

Aprender el empleo de una curva patrón para la determinación de la cantidad de moléculas presentes en una muestra, en este caso de proteínas


Determinar la concentración de proteínas en una muestra BSA, utilizando el método de Lowry





















MATERIALES Y MÉTODOS

MATERIALES:Material
Cant.
Nombre
Volumen
Reactivos
Concentración




Nombre
Cant.

Gradilla
1 unid.
-----------
-------------
-----------
--------
----------------------
Tubo de Ensayo
7 unid.
0
Blanco
6,0 ml
H2O
R.C.A
R.F
1,0 ml
1,0 ml
4,0 ml
----------------------


1
6,0 ml
BSA
H2O
R.C.A
R.F
0,1 ml
0,9 ml
1,0 ml
4,0 ml
0,0067 mg/ml


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