Metodo de obtencion

METODOLOGIA A DESARROLLAR, PARA LA CONSTRUCCION DE VECTORES LAMBA:1. número de vectores a tamisara. relación entre la talla del genóma y el contenido de un vector b. una sonda reconoce un fragmento del genóma2. marcaje de una sondaa. megaprima DNA rotulado
b. transcripción in vitro | 3. bancos de fagos y de cósmidosa. curva de calibración de fagos ó de cosmidos recombinantes
b. replicado de losclones recombinantes y liberación del ADN de cada uno
c. Hybridación y autoradiografia4. bancos de PAC, de BAC y de YAC.a. tamisage por hibridación5. camino en el cromosoma6. Southern blot |

1. número de vectores a tamisar 
a. relación entre la talla del genoma y el contenido de un vector El número de vectores recombinantes a tamisar para aislar una secuencia dada, presente en un banco, secalcula mediante la fórmula siguiente:

N = ln(1-P) / ln(1-f)

donde

N es el número de vectores recombinantes a tamisar
P es la probabilidad necesitada para encontrar un gen dado
f es la porción (en forma de fracción) del genoma clonado |
Por ejemplo, para tener un 99% de probabilidad de aislar una secuencia dada a partir de un banco de fragmentos de 17 kb (banco de fagos) de ungenoma haploide de un mamífero (3 x 109 bp), harían falta:N = 810.000 fagos recombinados.
Si, en el mismo banco de fagos, se busca una secuencia única de un genoma diploíde, por ejemplo un gen mutado, entoncesN = 1.600.000.En el caso de un banco de cósmidos, el número de clones recombinantes a tamisar es menor. Hecho debido a que los cósmidos aceptan fragmentos más grADNes de ADN extranjero (35 à 45kb). Para tener 99% de probabilidad de encontrar en un banco de cósmidos una secuencia única en el genóma haploide de mamíferos, haría falta obtener 350.000 clones recombinantes. Haría falta el doble (700.000) si la secuencia es única en un genoma diplode.
Como la talla del genoma de E. coli es 1.000 veces mas pequeña que aquella de una célula de mamífero, el número de clones recombinates atamisar para aislar un gen de ésta bacteria es 800 para el banco de fagos y 350 para un banco de cósmidos.Si se dispone de un banco de YAC recombinantes con una media de insertos de 650 kb, será suficiente clonar 20.000 clones para tener 99 % de probabilidad de encontrar ése gen único, en un genoma haploide de mamífero. |

b. una sonda reconoce un fragmento del genomaPara realizar un tamisage deun banco de fagos ó de cósmidos, se puede utilizar un fragmento ADN ó de ARN capáz de aparearse con la secuencia del gen aislado que se investiga. Este fragmento del ácido nucleíco se denomina una sonda. Esta sonda puede ser el ARNm correspondiente al gen que se estudia.
| Fué el gen coficador de la ß-globina el primer gen clonado de mamíferos, a partir del reticulocito de conejos, donde elARNm de la globina representa entre el 50 al 90 % de la totalitad del ARNm. La sonda puede ser igualmente un fragmento de ADN más grADNe que porta la totalidad de la secuencia del gen. La secuencia de la sonda puede también ser deducida de la secuencia de aminoácidos de la proteína purificada correspondiente. La sonde es con frecuencia marcada con un isótopo radioactivo, un reactivo que emite luz,una molécula que puede unirse a una enzima (biotina)... |

2. marcado de una sonda a. Megaprime DNA rotuladoLa secuencia de ADN que se quiere marcar es primero desnaturalizada por 2 minutos a 100°C. Después se agrega un nucleótido marcado al 32P (alpha32PdCTP), tres nucleótidos sin macar y el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I de E. coli en un tampón apropiado. El fragmento Klenow que poseeuna actividad 5'->3' polimerasa se sirve de una colección de nonámeros (9 nucleótidos) de secuencia aleatoria para iniciar la síntesis ADN a partir de la matríz de ADN denaturado y utilizADNo los tres nucleótidos no radioactivos (verde) y el nucleótido radioactivo (rojo). La reacción se realiza a 37 °C durante 5 a 10 minutos.

Pequeñísimas cantidades de ADN (20 ng) son suficientes para que...