Metodos de separación de proteinas

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Separacion de proteinas

Las proteínas son moléculas complejas, en cuya composición elemental se encuentran siempre presentes carbono, hidrógeno, oxígeno y nitrógeno. La mayoría de ellas incluyen también en su composición al azufre y en algunas se observa además la presencia de fósforo, hierro, zinc, molibdeno, u otros elementos (1).

Existen tres niveles de estructuras en una moléculaproteica. El orden o secuencia de los aminoácidos a lo largo de una cadena proteica constituye su estructura primaria, la cual confiere a la proteína su identidad individual. Un cambio de incluso un aminoácido puede alterar las características bioquímicas de la proteína. La estructura secundaria de una proteína se refiere a la orientación de los segmentos de la cadena proteica de acuerdo con un patrónregular. La forma global de una proteína, determinada por todos los recodos, giros y secciones de estructura α-helicoidal que semejan bastones, se conoce como su estructura terciaria (2).

Las enzimas son catalizadores biológicos, por lo regular proteínas, sintetizadas por organismos vivos. Suelen ser muy específicas y catalizan, cuando mucho, unos cuantos tipos de reacciones químicas.Frecuentemente, una enzima cataliza una solo reacción en la que intervienen una o dos moléculas específicas, pero no afecta a otras moléculas similares. En muchos casos, la actividad enzimática es regulada – es decir, intensificada o suprimida- por las propias moléculas cuyas reacciones las enzimas catalizan.

La función enzimática está íntimamente relacionada con la estructura de la enzima. Lasenzimas son proteínas con una forma tridimensional compleja. Cada enzima tiene una “bolsa”, llamado sitio activo, en el que pueden entrar las moléculas de los reactivos, llamados sustratos. El sitio activo de cada enzima tiene una forma y una distribución de cargas eléctricas distintivas, que se complementan con el sustrato. Dado que la enzima y su sustrato deben acoplarse, sólo ciertas moléculaspueden entrar en el sitio activo (3).

Las peroxidasas son un tipo de enzimas muy extendidas en toda la escala filogenética. Catalizan reacciones bisustrato de carácter redox, utilizando un peróxido como oxidante (a lo que deben su nombre) y un segundo sustrato de características reductoras que es oxidado por el peróxido.

Prácticamente todas las peroxidasas son hemoproteínas (a excepción de laglutatión peroxidasa, que es una selenoproteína) y tienen como substrato común el H2O2 o peróxido de hidrógeno. La gran afinidad por este sustrato hace que se pueda unir al hierro del grupo hemo por los dos planos del centro activo, el superior y el inferior, dando lugar a una inhibición por exceso de sustrato ya que cuando ambas posiciones están ocupadas por el peróxido de hidrógeno no es posiblela unión del otro sustrato.

Métodos de purificación de proteínas

Las proteínas se pueden purificar de acuerdo a sus características tales como solubilidad, tamaño, carga y afinidad específica de unión. El mecanismo habitual consiste en que la mezcla de proteínas se somete a diferentes separaciones, basándose en propiedades diferentes para obtener la proteína pura. En cada paso de purificaciónse practica el ensayo de actividad enzimática para determinar su concentración.

2.1.1 Diálisis

“Las proteínas se pueden separar de moléculas pequeñas mediante la diálisis a través de una membrana semipermeable, como puede serlo una membrana porosa de celulosa. Las moléculas de dimensiones significativamente mayores que el diámetro del poro se retienen dentro de la bolsa de diálisis,mientras que las moléculas más pequeñas y los iones atraviesan los poros de esta membrana y aparecen en el dializado, fuera de la bolsa. Esta técnica es útil para retirar las sales u otras moléculas pequeñas, pero no discriminará de forma efectiva entre las proteínas” (5).

2.1.2 Centrifugación

La centrifugación es una técnica de separación que se basa en el movimiento de las partículas...
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