Metodospara purificacion de anticuerpos

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METODOS PARA PURIFICACION DE ANTICUERPOS

ESPECIFICOS:
Un anticuerpo I(g)g3 se purifica mediante cromatografia de afinidad y mediante la recogida del anticuerpo liberado en un ph entre 9.0 y 9.6. la purificacion se efectua en una columna que contiene tanto una matriz de afinidad como una matriz desalinizadora. estando la columna equilibrada en un ph de entre 9.0 y 9.6. el anticuerpo i(g)g3puede ser almacenada a un ph entre 9.0 y 9.6.
La cromatografía de afinidad es una técnica usada en el aislamiento de anticuerpos o antígenos puros. El principio es simple y su aplicación, muy amplia. El antígeno o el anticuerpo está unido a través de sus grupos aminados libres a las partículas de Sepharose activadas con bromuro de cianógeno. Por ejemplo, puedenusarse anticuerpos insolubilizados para extraer el antígeno correspondiente de la solución, en la que está presente como un componente de una mezcla compleja, por absorción a su superficie. Los residuos que no interesan son eliminados por levado y el ligando requerido es liberado del absorbente de afinidad mediante la ruptura de los enlaces antígeno-anticuerpo por variacionesde pH o por el agregado de iones caotrópicos como el tiocianato .
Del mismo modo, puede utilizarse un antígeno a partir de una mezcla de donde puede purificarse por elusión. La cromatografía de afinidad es una técnica ampliamente utilizada en Bioquímica e Inmunología. Puede aplicarse en el aislamiento de una población pura de anticuerpos. Para ello se prepara uninmunoabsorbente en fase sólida, que es un antígeno unido covalentemente a un soporte inerte, como otro ejemplo bolitas de dextrano entrecruzadas.
El inmunoabsorbente, se coloca en una columna y la mezcla de anticuerpos se hace pasar a través de él bajo condiciones fisiológicas. Los anticuerpos específicos para el antígeno permanecen unidos a la columna, y aquellos que no seunen son eliminados mediante lavado. En el segundo paso, se eluye la columna, usando un tampón de elución que disocia la unión antígeno-anticuerpo (por ej., acetato a pH 3.0) para obtener el anticuerpo que se unió al inmunoabsorbente. A la inversa, colocando anticuerpos en la columna se tendrá antígeno puro. Esta técnica permite obtener otros tipos de moléculas. Así una columna de lectinaabsorberá todas las moléculas con determinados residuos azúcar, que pueden eluirse en un tampón con el azúcar libre, ya que éste compite con la proteína ligada por los sitios de unión a la lectina.
INESPECIFICOS:
. Precipitación con sulfato de amonio (salting out).
Procedimiento general: La muestra de proteína soluble debe de tener una concentración aproximada de 1 mg/ml en un buffer que contengacomo máximo 50 mM de EDTA. Lentamente agregar la solución de sulfato de amonio hasta obtener el porcentaje de saturación deseado, agitar de 10 a 30 min. Centrifugar y desechar sobrenadante.
Limitaciones: Muchas proteínas permanecen solubles a altas concentraciones de sales, por lo que no se recomienda este método cuando se requiere que el total de las proteínas este representado. Esté métodopuede ser empleado para prefraccionamiento o enriquecimiento de alguna fracción de interés. Las cantidades residuales de sulfato de amonio pueden interferir con el isoelectroenfoque y tiene que ser removido. Muchos contaminantes potenciales (ej. Ácidos nucléicos) permanecerán en solución.
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