Modernidad liquida

¿Cómo estudiar la expresión de diversos genes? Southern, Northern y Western Blot
Existen diferentes técnicas que emplean la separación en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas moléculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la detección de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza latransferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utilizó el mismo sistema para detectar ARN y se lo denominó Northern Blot (en clara alusión al nombre del científico inventor de la técnica basada en ADN).
Estas dos técnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean secuencias específicas (sondas) complementarias a la molécula deácido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridación de ácidos nucleicos para la detección de las moléculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho más fácilmente que el ADN; esto hace necesario tomar muchas más precauciones.
Una vez sembradas las muestras en un gel, serealiza una corrida electroforética hasta lograr que las moléculas se separen por tamaños de manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los ácidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridación con sondas específicas para detectar la presencia de determinadas secuencias.
Estas dos técnicas persiguenfines distintos: el Southern Blot, que detecta la presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qué genes son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos células del mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El Southern Blot nos permite evidenciar elmismo material genético y el Northern Blot, la expresión de diferentes genes.
Si luego queremos detectar proteínas, usaremos otra técnica similar: el Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa proteínas mediante la utilización de anticuerpos específicos. Una vez que la muestra con las proteínas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a una membranaespecial donde las proteínas quedan “ancladas” o adheridas. Después, se incuba esta membrana con el anticuerpo específico contra la proteína blanco, y se revela. Con esta técnica pueden obtenerse datos aproximados del tamaño de la proteína y su concentración en la muestra sembrada.
Protocolo
Para correr el gel de poliacrilamida necesitamos un tampon de corrida
(como se hace el gel lo vemos acaporque depende de los reactivos que
tengas y pueden haberalgunas variaciones pero pequeñas)

Buffer de corrida 10X

25 mM Tris
250 mM glicina
0,1% SDS (100 ml SDS 10%)
aforar a un litro.
solución de trabajo 1X (diluir con aguan destilada)

Después de corrido el gel tenemos que tener una matriz donde
inmobilizar las proteinas y en nuestro caso generalmente usamos
nitrocelulosa (hay unas dePVDB que tienen varias ventajas mas pero,
son mas caras y se tratan un poco diferente) y se utiliza un tampón de
transferencia.

Buffer de transferencia 10X

39 mM glicina
48 mM Tris
0,037 % SDS
20 %metanol

para preparar un litro de solución de trabajo 1X se hace un "truco"
que esta descrito hace años en un paper ultra viejo donde muestran que
aumenta el rendimiento de latransferencia cuando la solucion esta con
metanol. Para preparar el litro entonces:

diluyes: 100 ml de 10X llevándolo a 800 ml.
Después, a estos 800 ml le agregas 200 ml de metanol, ahi tienes tu
litro 1X con metanol

estos tampones se pueden utilizar unas 4 veces, o sea lo usas y los
recuperas. De todas formas yo trato de utilizarlos dos veces máximo
para asegurarme que todo sale bien y obtener...