Muerte

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  • Publicado : 22 de noviembre de 2010
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Cultivacion de celulas, transfección transitoria y ensayos de genes reportados:
Cuatro tipos de muestras fueron utilizados: Hepatoblastoma humano Hep-G2, carcinoma hepatocelular humano HuH-7,carcinoma hepatocelular humano PLC/PRF/5 y células renales embrionarias humanas HEK 293.
Las células Hep-G2 fueron utilizadas como el centro principal del experimento, HuH-7 y PLC/PRF/5 se utilizaronpara confirmar los resultados de Hep-G2 y HEK293 fue utilizado como control.
Cada tipo de célula fue cultivada en un ambiente específico. Todos los medios contenían L-Glutamine,10% suero bovino fetal, 100units/ml de penicilina y 100mg/ml de estreptomicina. Los cultivos se mantuvieron en una atmosfera humidificada a 37°C y 5% de CO2.
La transfeccion se realizó con elreagente Tfx-20 y se siguió el protocolo normal del procedimiento. A las células se le cotransfirieron con un derivado pGL4 plasmido experimental y otro plasmido pRL-TK conteniendo el gen “Luciferase”derivado de la “Renilla reniformis.”
La lisis celular y la determinación de la actividad del gen luciferasa fueron determinadas con un ensayo llamado “Dual Luciferase Reporter Assay”.
Las célulasfueron cultivadas durante 48 horas después de la transfección y fueron inducidas a lisis con 200 µl de un buffer pasivo de lisis.

10 microlitros de la célula lisada fue mesclada con 50µl de“luciferase Assay Reagent II” en un tubo luminometro. La luz emanada por el “firefly luciferase” fue medida inmediatamente por 10 segundos después de una segunda remedida realizada con otro aparato.

Almismo tiempo en otro tubo, 10 µl de célula lisada fue mesclada rápidamente con 50 µl de un reagente. La emisión de luz de la “renilla luciferase” fue medida por dos segundos después de la primerapremedida.

Para reducir la dispersión de la “Photinus Luciferase” causada por variaciones en el número de células y la eficiencia de la transfección, los datos fueron contrastados con la señal...
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