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Práctica 5
CINÉTICA ENZIMÁTICA: DETERMINACIÓN ESPECTOFOTOMÉTRICA DE LA CONSTANTE DE MICHAELIS-MENTEN DE LA PAPAÍNA

1. Objetivo Se pretende calcular la constante de Michaelis-Menten (KM), la constante catalítica (kcat) y la velocidad máxima inicial (Vmax) de la reacción de proteolisis de un sustrato específico (N-benzoil-arginina-p-nitroanilida, BAPNA) catalizada por la proteína papaína. 2.Fundamento teórico 2.1. Actividad enzimática Los enzimas son proteínas altamente especializadas que catalizan numerosas reacciones en los sistemas biológicos. Una propiedad importante es su especificidad a la hora de reaccionar con sustratos, acelerando determinadas reacciones químicas en disolución. En general, un enzima proporciona el ambiente en que una reacción determinada es, energéticamente,más favorable. El rasgo distintivo de una reacción catalizada enzimáticamente es que ocurre en un lugar específico del enzima, el sitio activo. La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa el enzima se denomina sustrato. El complejo enzima-sustrato formado es de vital importancia para definir el comportamiento cinético de las reacciones catalizadas. Una reacción enzimática sencillapuede formularse como sigue: E+S k1 k-1 ES k2 k-2 E+P [1]

donde E, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente. ES y EP son complejos del enzima con el sustrato y con el producto. La función del catalizador es aumentar la velocidad de una reacción reduciendo la energía de activación de la misma, Ea. Los catalizadores no modifican los equilibrios de la reacción ni se consumendurante el proceso. En esta práctica se estudia la cinética de ruptura del enlace peptídico de la molécula N-benzoil-arginina-p-nitroanilida (BAPNA) catalizada por la papaína, una proteína de peso molecular 23.400 g/mol (ver Esquema 1).
Prácticas de Termodinámica y Cinética-2º curso Licenciatura de Biotecnología

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Esquema 1

Esta proteína pertenece al grupo de enzimas tiol-proteasas, ya queen el sitio activo se encuentra un grupo sulfhidrilo (-SH). La papaína se encuentra en el extracto de la papaya y tiene varios usos comerciales. Por ejemplo, en la industria de la cerveza hidroliza proteínas que provocan su turbidez. También es usada para evitar el endurecimiento de la carne, mediante la hidrólisis de enlaces peptídicos del colágeno de los tejidos conectivos, la elastina y laactomiosina. Finalmente, también se usa en la limpieza de lentes de contacto, eliminando los depósitos proteicos. La interacción específica con el sustrato (BAPNA) se produce a través del residuo de fenilalanina. La hidrólisis de este enlace peptídico genera entre otros productos de reacción, la p-nitroanilina, de color amarillo, lo que permite seguir espectofotométricamente el progreso de lareacción mediante la medida de la velocidad de formación de este producto. Con este objeto se mide el aumento de absorbancia de la disolución con el tiempo, a la longitud de onda de máxima absorción de la p-nitroanilina ( max=400 nm, coeficiente de extinción molar, = 1.08·10-4 M-1cm-1) para distintas concentraciones iniciales de BAPNA. La concentración de producto se obtiene aplicando la ley deLambertBeer (A=εlc). 2.2. Velocidad de reacción. Cinética de Michaelis-Menten La velocidad de una reacción cualquiera viene determinada por la concentración de reactivo/s y por una constante de velocidad, k, y expresada por una ley de velocidad. Por ejemplo para una reacción unimolecular o de P, la cantidad de S que ha reaccionado por unidad de primer orden, S tiempo viene dado por la siguiente expresión:V =− d [S ] d [P ] = = k [S ] dt dt

[2]

donde k, tiene unidades de s-1 y S de mol·l-1. Así pues, la concentración de sustrato, [S], afecta a la velocidad de una reacción catalizada por un enzima. No obstante, el estudio del efecto de [S] en una reacción enzimática no es simple. Este tipo de comportamiento cinético es explicado por la teoría de
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