Pirosecuenciacion

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PIROSECUENCIACION

AUTOR: Bianca Ethel Gutierrez Amavizca
22 de Noviembre 2010
Doctorado Genetica Humana

El objetivo de este trabajo es analizar un artículo relacionado a secuenciación. En este caso se escogió un artículo de revisión de Pirosecuenciación: Discovery of single nucleotide polymorphisms and mutations by Pyrosequencing Mostafa Ronaghi , Elahe Elahi Comp Funct Genom 2002; 3:51–56.

En la actualidad la determinación de mutaciones y polimorfismos en un genoma es una de las tareas más importantes en los estudios de los sistemas biológicos. Tres plataformas de secuenciación de ADN están siendo utilizados para análisis de mutaciones y polimorfismos. Estos incluyen secuenciación de ADN por el método de Sanger, secuenciación basada en hibridación y Pirosecuenciacion.La pirosecuenciación está basada en la detección de pirofosfato liberado (PPi) durante la síntesis de ADN. Se trata de un método simple y consistente, útil para la secuenciación de fragmentos de ADN de tamaños pequeños o medianos. En una cascada de reacciones enzimáticas, la luz visible es proporcional al número de nucleótidos incorporados que son generados. La cascada se inicia con una reacciónde polimerización de ácido nucleico en el que el pirofosfato inorgánico (PPi) se libera como consecuencia de la incorporación de nucleótidos por la polimerasa. El PPI liberado es subsecuentemente convertido a ATP por la enzima ATP sulfurilasa, la cual proporciona la energía para la luciferasa para oxidar luciferina y generar la luz. Desde el nucleótido añadido que se conoce, la secuencia del DNAplantilla se puede determinar La Pirosecuenciación tiene las ventajas potenciales de precisión, flexibilidad, procesamiento en paralelo y puede ser fácilmente automatizado. Además, prescinde de la necesidad de cebadores marcados, nucleótidos marcados y geles de electroforesis. La Pirosecuenciacion permite la determinación de las difíciles estructuras de ADN secundaria, la detección de mutaciones, elanálisis de DNA, re- secuenciación de genes asociados a enfermedades, tipificación bacteriana, tipificación viral y el análisis de polimorfismo de nucleótido único. La Pirosecuenciación permite que más de 50 nucleótidos sean secuenciados de novo de forma rutinaria. La pirosecuenciación puede ser el método de elección para la secuenciación de difíciles estructuras de ADN secundaria que no puedeser secuenciados por secuenciación convencional.

En esta revisión, se discuten el uso de pirosecuenciación para mutación de exploración, análisis y detección de SNP y haplotipos, y describir los esfuerzos de reducción de costos de gran escala los estudios. Si se conoce la mutación, la región que contiene la mutación puede ser analizada en o cerca del sitio de la mutación. Si la mutación esdesconocida, re-secuenciación de la región para la determinación de la naturaleza de la mutación es necesario. Cuando el ADN proveniente de biopsia se está resecuenciando, un método cuantitativo para La capacidad de secuenciar un gran número de muestras de ADN de forma rápida y precisa para la detección de todas las posibles mutaciones es un objetivo fundamental en biomedicina.

determinar larelación entre la plantilla de DNA de salvajes y mutantes es requerida. Al analizar las muestras de heterocigotos, la secuenciación del ADN convencionales no revela la proporción exacta de ADN mutado con el tipo salvaje y muy a menudo ni siquiera se puede detectar la mutación en el proporción es inferior a 0,5. Sin embargo, la Pirosecuenciación ha demostrado que producen datos cuantitativos y ha utilizadopara detectar alelos con una frecuencia tan baja el 5%. Aunque esta precisión sólo se obtiene con polimorfismos conocidos, una proporción de 0,3 puede ser detectado con un relativamente alta precisión durante la exploración para la mutación.

Un aspecto importante de esta técnica es que todos los pasos se realizan “in vitro”, a diferencia de la tecnología Sanger. Esta técnica comienza con el...
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