Practica De Inmunologia

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID  FACULTAD DE VETERINARIA
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PRÁCTICAS DE INMUNOLOGÍA CURSO 2009-2010
En este Curso Académico se llevaran a cabo las siguientes prácticas de laboratorio: I. Detección de anticuerpos frente al virus de la enfermedad de Aujeszky mediante un ELISA de competición y un ELISA indirecto. II. Determinación mediante la técnica de aglutinación rápida de grupossanguíneos y factor Rh humano. III. Detección de anticuerpos frente a Listeria sp. y frente a Salmonella sp. mediante microaglutinación lenta en placa. IV. Determinación de los anticuerpos calostrales en sueros de terneros. V. Resolución de supuestos prácticos. I. MÉTODO ELISA La técnica inmunoenzimática ELISA (Enzyme-Llinked Immunosorbent Assay) forma parte de aquellas reacciones serológicas queutilizan conjugados para poder visualizar la reacción ANTIGENO-ANTICUERPO. El ELISA se basa en el uso de anticuerpos marcados con una enzima (generalmente la peroxidasa), de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) insolubilizados sobre la placa, la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada ypor tanto, podrá ser revelada fácilmente mediante la adición del conjugado y del sustrato, generando un color observable a simple vista y cuantificable mediante un colorímetro. En la actualidad el ELISA es uno de los métodos más utilizados para el diagnóstico serológico de distintas enfermedades infecciosas, y es la técnica más recomendada para el estudio de poblaciones. Se han adaptado diferentestipos de ELISA tanto para la detección de antígenos como de anticuerpos. En esta práctica utilizaremos dos tipos de ELISA para la detección de anticuerpos fente al virus de la Enfermedad de Aujeszky (ADV) en sueros de cerdo.

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I. 1. PRINCIPIO DEL TEST de la Enfermedad de Aujeszky (ADV) La glucoproteína E (gE) no se encuentra en las cepas vacunales del virus de la enfermedad de Aujeszkyutilizadas en España. Por lo tanto, la detección de anticuerpos específicos frente a gE en muestras de sueros de cerdos permite la diferenciación entre animales vacunados, sanos e infectados por este virus. En estas prácticas vamos a emplear dos kits comerciales basados en: ELISA de competición (o de bloqueo): detecta sólo Ac frente a gE. Los pocillos están tapizados con la proteína gE del virus.ELISA indirecto: detecta Ac totales frente a ADV. Los pocillos están tapizados con antígeno inactivado de ADV completo.

En ambos casos si en la muestra de suero a analizar hay anticuerpos específicos éstos se fijan sobre el Ag fijado a la placa, por lo que la reacción de ELISA será positiva. La forma de evidenciar esta unión Ag-Ac es diferente en función de la metodología empleada: En el ELISA decompetición a continuación se incorpora a los pocillos un anticuerpo monoclonal anti-gE del ADV conjugado con una enzima. En los casos en que en la muestra de suero haya anticuerpos anti-gE, este conjugado no puede unirse a la gE (Figura 1), por lo que se eliminará en los siguientes lavados. En el ELISA indirecto a continuación se incorpora a los pocillos un anticuerpo monoclonal anti-Ig de cerdoconjugado con una enzima. En los casos en que en la muestra de suero haya anticuerpos anti-ADV, este conjugado se unirá a los Ac específicos del suero, unidos a su vez al Ag fijado al pocillo (Figura 2).

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En ambos casos el revelado se realiza por la adición de un sustrato cromógeno. La presencia o ausencia de color indica diferentes resultados en función de la prueba: En el ELISA decompetición la ausencia de color indica la presencia de Ac anti-gE en el suero problema, que será positivo. En el ELISA indirecto el desarrollo de color indica la presencia de Ac antiADV en el suero problema, que será positivo.

La intensidad de color se mide con un lector de ELISA con un filtro de 450nm, y los sueros a ensayar se comparan con los sueros controles que se incluyen en el kit. 1.2....