Practica de proteinas

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Determinación del punto isoeléctrico de la Caseína

Objetivo: Determinar el punto isoeléctrico de la caseína usando soluciones de ácido acético de diferentes concentraciones

Fundamento: El punto isoeléctrico es cuando las proteínas tienen un pH característico al cual su carga neta es cero.

El punto isoeléctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por loque la proteína presenta su máxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregación.

Es decir, todas las proteínas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que se encuentren y de los aminoácidos que la componen, así como de las cargas de cualquier ligando que se encuentre unido a la proteína de forma covalente (irreversible).

Debido a lacomposición en aminoácidos de la proteína, los radicales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catiónicos, neutros y aniónicos.

Cualquier proteína tendría una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente ácido debido a que los grupos COOH de los aminoácidos aspártato y glutámato estarían en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina ylysina estarían protonados (-NH3+).

De igual forma si la proteína se encuentra en un medio con un pH muy alto estaría cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estarían desprotonados (COO-) y los grupos amino estarían en su forma neutra (NH2).

Desarrollo:
Preparar una serie de 10 tubos de ensayo, con las soluciones que se indican en la tabla de la página siguiente.
[pic]Cuestionario
1. Calcule el pH teórico de cada tubo y anótelo en la tabla, marcando el punto Isoeléctrico de la Caseína.

Reacción de Ninhidrina.

Objetivo: Detectar y cuantificar cantidades de aminoácidos libres

Fundamento: Los aminoácidos, en general reaccionan con la Ninhidrina (hidrato de hicelohidrandeno) cuando son calentados con un exceso de la misma. Todos los aminoácidos queposeen un grupo amino libre reaccionan y forman dióxido de carbono, amoníaco y un aldehído que contiene un átomo de carbono menos que el compuesto original. Esta reacción da lugar a la formación de un producto color azul o púrpura (que posteriormente puede ser utilizado para cuantificar el aminoácido). En
el caso de la prolina, que estructuralmente no posee el grupo amino libre, sino un grupo imino,la coloración final es amarilla. El amoníaco, la mayoría de los polipéptidos y las proteínas pueden desarrollar coloración en esta reacción, pero a diferencia de los aminoácidos, no liberan CO2. Recuerde que la coloración azulada o violeta será proporcional a la concentración del aminoácido. Todos los aminoácidos primarios reaccionan con dos moléculas de ninhidrina para formar un cromóforo (púrpurade Ruthermann)
El método se basa en la reacción entre la ninhidrina y el grupo -amino de aminoácidos, péptidos y proteínas, dando un compuesto coloreado azul o azul - violeta.
Calentar en presencia de ninhidrina produce la desaminación oxidatíva de los grupos amino en lo que implica la reducción asociada de la molécula de ninhidrina
La ninhidrina reducida reacciona con el amonio y con otraninhidrina oxidada para dar ligar a un compuesto coloreado llamado azul - violeta de Ruhermann.

Desarrollo:
[pic]

Cuestionario:
1. Escriba la reacción química efectuada. [pic]
2. Escriba los nombres de otras sustancias que dan positiva la reacción de Ninhidrina, además de proteínas, péptidos y aminoácidos.
R= La prolina y la oxiprolina reaccionan con la ninhidrina, pero dan un positivo decolor amarillo, café para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. La reacción de la ninhidrina puede dar positivo con ciertas aminas, aminas ácidas y algunos otros compuestos.

Bibliografia:
http://www.pucmmsti.edu.do/cienciasfisiologicas/BQMA-SIB2.PDF
Mathews Van Holde . 2004 Bioquímica. 3 Ed Pearson. España
Murray, Granner, Mayes & Rodwell. “Harper Bioquímica...
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