practicas diagmol

Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Biologicas

Diagnóstico Molecular

Reportes de prácticas de Laboratorio de 3er Parcial

Ariana Elizabeth Tarín Hernández
Matricula: 1576797 Grupo:443
Dra. Griselda Menchaca


Practica #1 y 2
Obtención de RNA de rotavirus por medio de fenol-cloroformo
Electroforesis en gel de poliacrilamida y Tinción con nitrato de plataINTRODUCCION
Es un virus llamado así por sus partículas virales en forma de rueda vistas en el microscopio electrónico. El rotavirus es la principal causa de enfermedad diarreica y deshidratación en niños pequeños. Se presenta en todo el mundo y afecta entre el 90 y el 100% de la población antes de los 3 años de edad. Es responsable de veinte de cada cien muertes por diarrea en el mundo en losmenores de 5 años. El rotavirus en general destruye al enterocito (células intestinales), produciendo así la pérdida de sustancias necesarias para la absorción de sodio y agua; asimismo hay disminución en la absorción de proteínas, grasas y carbohidratos. La muerte de pequeñas zonas del intestino produce un aumento en substancias toxicas, provocando más daño al intestino, que produce aumento en elmovimiento intestinal por parte del sistema nervioso intestinal, dando como resultado una mala absorción de los alimentos.
Extraccion de RNA por Fenol-Cloroformo
El RNA es el ácido nucleico más abundante en la célula, y puede purificarse fácilmente. Una célula típica contiene 10 veces más RNA que DNA. Existen variadas metodologías para la extracción de RNA. Son bastante comunes los protocolos queincluyen isotiocianato de guanidinio o fenol para el lisado celular. Dichos compuestos inactivan RNAsas lo que resulta muy favorable cuando se trabaja con muestras que poseen altos niveles de RNAsas endógenas. En la técnica de fenol-cloroformo, el primero se utiliza para la desnaturalización y solubilización de las proteínas y componentes celulares y el cloroformo permite la separación de lasfases durante la centrifugación, además de también ser desnaturalizante
PAGE
PAGE, por sus siglas en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis". Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para separaciones electroforéticas, dado que reúnen una serie de propiedades idóneas: transparencia, elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad decompuestos químicos. Es una técnica ampliamente utilizada en bioquímica, genética, biología molecular y ciencia forense para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética en función de la longitud de la cadena polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros factores.


Tinción con Nitrato de Plata.
La detección en geles de poliacrilamida teñidos con nitratode plata ofrece, según nuestra experiencia, la mejor relación costo-beneficio. Aunque laboriosa esta metodología ofrece una alta resolución, requiere de equipos “poco” sofisticados. El gel se impregna con nitrato de plata y se revela por reducción con formaldehído a pH básico, permite detectar entre 5-10 ng/punto y es compatible con MS siempre que nose utilice glutarahdehído.

Materiales yMetodos.
1. Elaborar una suspensión de heces diamcicas al 20% se colocan en un tubo eppendorf de 1.5ml (200µl de suspensión más 800µl de PBS).
2. Mezclar por 2min en vortex.
3. Se centrífuga a 12,000 rpm en un periodo de 5 minutos.
4. Al sacarlo de la centrífuga se toman 200 L del sobrenadante y se le coloca en otro tubo eppendorf nuevo.
5. Al sobrenadante se le agrega 200 L de buffer lisis(β-mercaptoetanol).
6. Se homogeniza en el vortex por un tiempo de 2 minutos
7. Se agrega 200 L de fenol- cloroformo con Tris pH 8
8. Se homogeniza en el vortex por un tiempo de 2 minutos
9. Se agrega 200 L de cloroformo
10. Se homogeniza en el vortex por un tiempo de 2 minutos y se centrífuga a 14,000 rpm en un periodo de 5 minutos.
11. Al sacarlo de la centrífuga se aprecian dos fases y...