Preparacion De Soluciones Buffer

GUÍAS DE LABORATORIO DE

QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

PARA CARRERAS DEL ÁREA DE LA SALUD

ODONTOLOGÍA

Autoras: Paola Campodónico, PhD.
Paulette Conget, PhD.


2007

LABORATORIO Nº 1

Existen numerosos procedimientos analíticos para cuantificar la concentración de la glucosa en la sangre, siendo rutinariamente utilizados los métodos enzimáticos, dada sualta especificidad y sensibilidad. En este trabajo práctico se utilizará el método de la glucosa oxidasa (GOD), acoplado a una reacción colorimétrica catalizada por la enzima peroxidasa (POD).

Las reacciones involucradas en el ensayo enzimático son las siguientes:

Glucosa (muestra) + O2 + H2O

GOD

gluconolactona + H2O2

2 H2O2 + 4-aminofenazona + fenol

POD4 H2O + 4-(p-benzoquinonamonoimino)fenazona

El último producto generado en esta serie de reacciones es coloreado, por lo tanto puede absorber la luz visible y en consecuencia puede cuantificarse espectrofotométricamente (ver anexo de espectrofotometría). Dado que la producción de 4-(p-benzoquinonamonoimino)fenazona es directamente proporcional a la concentración de glucosa, sepuede construir una curva de calibración generada a partir de soluciones de concentración conocida (estándar) de glucosa y las mediciones de absorbancia del producto final del ensayo enzimático. Para conocer la concentración de glucosa de una muestra desconocida, realizamos el ensayo y medimos la absorbancia del producto. Este valor de absorbancia puede ser interpolado en la curva de calibraciónpara conocer la concentración de glucosa.

TAREAS PREVIAS

- Cálculos para preparar estándares de glucosa mediante dilución seriada de la solución stock.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Materiales
1 micropipeta p20
1 micropipeta p1000
puntas para p20
puntas para p1000
15 tubos eppendorfs
1 microplaca
lector de microplaca
rotulador

1,5 ml suero fisiológico
1 ml glucosa 400 mg/dl(solución stock)
3 ml reactivo R1
0,1 ml plasma A (muestra)
0,1 ml plasma B (muestra)

Procedimiento experimental

1. Preparación de estándares de glucosa

* rotular 5 tubos eppendorfs para preparar las soluciones estándares de glucosa
* preparar 500 l de los estándares de glucosa (400, 200, 100, 50 y 25 mg/dl), haciendo diluciones seriadas en suero fisiológico a partir de la soluciónstock de glucosa.

2. Obtención de plasma sanguíneo (ya fue hecho, Ud. recibirá el plasma)

* rotular 1 tubo eppendorf para colectar el plasma sanguíneo
* centrifugar 2 min a 800 x g (1500 rpm) la muestra de sangre heparinizada para separar el plasma de los elementos figurados
* aspirar con la micropipeta el plasma, sin distorsionar el pellet celular
* recuperar el plasmaen tubo eppendorf limpio rotulado

3. Ensayo enzimático y medición de absorbancia

* rotular 8 tubos eppendorfs para preparar las mezclas de reacción
* preparar las mezclas de reacción, agregando a cada tubo los volúmenes de reactivos indicados en la siguiente tabla 1. Es recomendable, para sincronizar lo más que se pueda las reacciones, agregar el reactivo R1 a todos los tubos yluego comenzar a agregar los 3 µl de muestra a los tubos correspondientes. Luego de haber agregado la última muestra agitar todos los tubos simultáneamente.

Tabla 1

Tubo | Reactivo R1 | Muestra |
0 (blanco) | 300 l | 3 l suero fisiológico |
25 | 300 l | 3 l glucosa 25 mg/dl |
50 | 300 l | 3 l glucosa 50 mg/dl |
100 | 300 l | 3 l glucosa 100 mg/dl |
200 | 300 l | 3 l glucosa200 mg/dl |
400 | 300 l | 3 l glucosa 400 mg/dl |
Muestra A | 300 l | 3 l plasma A |
Muestra B | 300 l | 3 l plasma B |

* incubar 30 min. a temperatura ambiente
* transferir 150 l de cada reacción a un pozo de la microplaca, registrando la localización de cada muestra
* medir la absorbancia a 505 nm (A505) en lector de microplaca

ANEXO ESPECTROFOTOMETRÍA

La...