Propiedad optica de proteinas

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Fecha: 14/4/2011

Grupo: Ottaviano Noelia, Coda Valeria, Hormazabal Ana Clara

Comisión Nº 9

Trabajo Práctico Nº 1: CUANTIFICACION DE PROTEINAS. PROPIEDADES OPTICAS DE PROTEINAS

Objetivos: Dosar proteínas mediante los métodos propuestos y comparar los resultados obtenidos.

Fundamentación teórica: Todas las proteínas absorben por debajo de los 230 nm, esto se debe al enlace peptídico,pero a esta longitud de onda también absorben otros compuestos que pueden causar interferencias en las determinaciones.
Los aminoácidos aromáticos absorben en la región del UV cercano a 280 nm estas medidas se pueden utilizar para determinar la concentración de proteína de una solución.

Los métodos que utilizamos en el laboratorio para cuantificar proteínas son los siguientes:

1) Métodode Gornall (reacción del Biuret): Cuando la urea se calienta a 180ºC se descompone en un compuesto llamado Biuret, que en presencia de Cu2+ da un complejo azul violáceo. La unión peptidica reacciona de la misma manera que el Biuret con el Cu2+.

La sensibilidad del método es baja (0,2 a 1,5 mg de proteína en volumen final), por eso se utiliza para cuantificar proteínas en preparados muyconcentrados.

El máximo de absorción del complejo proteína-Biuret se produce a 545nm.

2) Método de Bradford: se basa en la cuantificación de la unión entre el colorante Azul Brillante de Coomassie a una proteína desconocida y la comparación de esta unión con la de diferentes cantidades de una proteína estándar. Este complejo presenta un máximo de absorción a 595nm. Es un método más sensible queel método de Biuret (1 a 10 µg de proteínas en el volumen final)

Resultados obtenidos:

Método de Bradford:

Testigo: BSA 0.1 µg/ µL

|TUBO |µg BSA |µL BSA |µL H2O |µL Azul Brillante|abs1 |Abs 1- bco |abs2 |Abs2-bco |
|Blanco |0 |  |500 |500|0,14 |0 |0,14 |0 |
|1 |1 |10 |490 |500 |0,17 |0.03 |0,163 |0.023 |
|2 |1.5 |15 |485 |500 |0,137 |0.047 |0,173 |0.033|
|3 |2 |20 |480 |500 |0,195 |0.055 |0,177 |0.037 |
|4 |2.5 |25 |475 |500 |0,218 |0.078 |0,202 |0.062 |
|5 |3 |30 |470|500 |0,21 |0.07 |0,196 |0.056 |
|6 |3.5 |35 |465 |500 |0,214 |0.074 |0,25 |0.065 |
|M1 |  |150 |350 |500 |0,745 |0.605 |0,726|0.596 |
|M2 |  |150 |350 |500 |0,213 |0.073 |0,19 |0.05 |

Ab1 y Abs2 : absorbancias medidas.

Abs 1- bco y Abs2-bco: son las absorbancias corregidas, es decir la absorbancia medida menos la absorbancia del blanco.

Curva 1

[pic]

Curva 2

[pic]

M1⋄ presento un valor de absorbancia que cae fuera de la curva de calibración, debido a esto no se le puede aplicar este método, por lo que no puede obtenerse un resultado preciso de la concentración de dicha muestra. Para poder hacerlo, se deberían realizar diluciones seriadas hasta obtener un valor de absorbancia que entre dentro del rango de la curva de calibración.

M2 ⋄ presento un valor de...
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