Propiedades físico-químicas de las proteínas. aislamiento de proteínas y determinación de sus caracterísicas moleculares.

Páginas: 14 (3476 palabras) Publicado: 5 de noviembre de 2011
1. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS:

Es una práctica importante en el laboratorio. Para poder seguir el aislamiento de una proteína, en primer lugar hay que considerar los sistemas de detección posibles. Hay dos sistemas:

a) Sistemas generales: van a detectar proteínas en general, sin diferenciar unas de otras.
b) Sistemas específicos: permiten detectar una proteína concreta. Hacenuso de alguna propiedad característica/particular de la proteína a detectar. Habitualmente esta propiedad es su actividad o función, p.e. la actividad enzimática va a ser una propiedad fundamental (uso de una reacción). También se puede hacer uso de una propiedad estructural, p.e. el poseer un grupo que le confiera color en el caso de proteínas con grupos prostéticos que a menudo tienenpropiedades espcetrosópicas de absorción en el visible o proteínas que contienen nucleótidos que les confieren color rojo, marrón o naranja.

Las técnicas utilizadas para la detección de proteínas en general se basan:
a) en la capacidad que tienen casi todas las proteínas de absorber a 280nm, por la presencia de aa aromáticos
b) en agentes químicos: tinción de la proteína con productos químicos queproporcionan derivados coloreados o fluorescentes. Además de la detección permiten la cuantificación tanto de proteínas como de péptidos y aa libres.

Agentes químicos:

a) que reaccionan a través del extremo amino terminal:

• Cloruro de dansilo

- se mantiene el pH en torno a 10 para que el grupo amino no esté protonado
- se obtiene un derivado dansilaminoácido DNS-aa, fluorescente
- esun método muy sensible

• Reactivo de Edman o feniltioisocianato

- muy utilizado para la determinación de la estructura primaria
- se obtiene un derivado feniltiohidantoina-aa o PTH-aa

• Ninhidrina

- todos los aa excepto la prolina dan lugar a un producto que absorbe a 590nm y tiene color púrpura.
- la prolina da un producto amarillo que absorbe a 400nm
- se emplea de forma universalen el análisis automático.

• Reactivo de Folin-Ciocalten

- posee sales de Cu, Mo y W
- oxida la tyr, que primero se desprotona formando tirosinato y luego la quinona, de color azul, que permite su detección y cuantificación.
- además los grupos NH de la cadena forman un complejo con el Cu, también de color azul
- Este reactivo se usa casi siempre con la técnica de Lowry. La técnica deBiuret, bastante similar, también usa sales de cobre para detectar y cuantificar.

SEPARACIÓN O ASLAMIENTO DE PROTEÍNAS:

1ª etapa: homogenización:

Consiste en la ruptura de tejidos, células y partículas subcelulares, de modo que se puede solubilizar la proteína. Hay 3 criterios fundamentales a la hora de elegir el método:
- dureza del tejido
- localización de la proteína en la célula
-estabilidad de la proteína

Técnicas de homogenización:

1.- abrasivos: se machaca el tejido en un mortero con adición de arena. Se usa para tejidos duros, p.e. hueso.
2.- homogenizadores de aspas: trituradora que usa la fuerza de cizalla de las aspas (tipo minipimer). Tejidos no muy duros, pero consistentes y tejidos blancos, p.e. corazón, riñón..
3. potter: consta de un recipiente devidrio o metal alargado en el que se introducen fragmentos de tejido y un tampón con un émbolo. El movimiento del émbolo hace pasar el tejido entre éste y la pared, triturándose. El émbolo se conecta a un motor que lo hace girar rápidamente aumentando la eficacia de las fuerzas de cizalla, que son las responsables de la trituración. Se usan para tejidos blandos, p.e. pulmón, hígado, cerebro..
4.lisis: utilización de medios hipotónicos o hipertónicos para que las células se rompan. Es más frecuente el empleo de medios hipotónicos (medios de menor concentración salina): al entrar el disolvente en la célula por haber menor presión osmótica aumenta la presión y la célula se rompe. Se usa para células libres, p.e. cultivos bacterianos.

La localización de la proteína es importante porque...
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