Proteinas y su secuanciacion

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PURIFICACION DE PROTEINAS.

EXTRACCION DE PROTEINAS DE LAS CELULAS:
• Extracción de la fuente.
• Homogenización.
• Remoción de impurezas.
• Fraccionar la proteína.
• Almacenamiento.SALTING OUT:
• Luego de solubilizarse las proteínas pueden purificarse en base a la solubilidad.
• Depende de la carga neta, la fortaleza iónica y la polaridad.
• Se utiliza NH4SO4 parallevar a cabo el proceso de salting out.
CROMATOGRAFIA DE COLUMNA:
• FASES:
1. Estacionaria.
2. Móvil.
• TIPOS:
1. Exclusión o de gel.
2. Afinidad.
3. Intercambio de iones.ELECTROFORESIS:
• Definición.
• Tipos:
1. Agarosa.
2. SDS-PAGE.
3. Isoelectric focusing: se basa en los diferentes puntos isoeléctricos. Según la proteína migra se encuentra en diferentes pH yla carga de la proteína va cambiando. Cada proteína se detiene en su punto isoeléctrico.

DETERMINACION ESTRUCTURAL Y PASOS A SECUENCIAR DE UNA PROTEINA.
DETERMINACION ESTRUCTURAPRIMARIA:
• Pasos:
1. Determinar la composición y la cantidad de amino ácidos.
2. Determinar el N-terminal y el C-terminal.
3. Determinar la secuencia de la cadena.
PASOS PARA SECUANCIAR UNAPROTEINA:
• Determinación de la composición de amono ácidos: tipos y cantidades.
• Identificación del N- terminal:
1. Método de Sanger: FDNB.
2. Método de cloruro de dansilo.
3.Degradación de Edman: PITC.
4. Aminopeptidasas.
5. 2-4 dinitro fluorobenzeno.
• Rompimiento puentes de azufre: oxidación (acido performico) o de reducción (ditioeritriol o B-mercaptoetanol).
•Identificación C-terminal:
1. Hidracina.
2. Borohidruro de litio.
3. Carboxipeptidasas.
• Para determinar la composición de la cadena:
1. Hidrólisis completa.
2. Hidrólisis parcial:
a.Tripsina: Lys, Arg (C) a.a.1.
b. Quimotripsina: Phe, Tyr, Trp (C) a.a.1.
c. Pepsina: Phe, Try, Trp, (N) a.a.1.
d. Bromuro cianuro: Met (C) a.a.1.
e. Termolisina: Leu, Ilu, Val a.a.2.
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