Protocolo inmunohistoquimica

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  • Publicado : 17 de febrero de 2011
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Protocolo Inmunohistoquimica
Día 1
1. SECAR LAS PREPARACIONES: 2h en la estufa a 40ºC o toda la noche a temperatura ambiente.

2. LAVAR: se realizan 3 lavados de 10 min cada uno en PBS1X (0.1M). Con la pipeta se cubre bien todo el tejido y se vuelca el porta para retirar el PBS.

3. PERMEABILIZACIÓN: se tratan las muestras con una solución de IGEPAL (Sigma) al 0.1% en PBS 1xdurante 10-20 min dependiendo de la localización de tu proteína. (30-50 μL dependiendo del tamaño de la muestra, lo importante es que se cubra bien todo el tejido).

4. INACTIVACIÓN DE LAPEROXIDASA ENDOGENA: para ello tratamos con H2O2 al 3% (tener en cuenta que el H2O2 está al 30%) en PBS 1X durante 20 min (30-50 μL por muestra).

5. LAVADOS: se realizan 3 lavados de 10 min cada unoen PBS 1X.

6. BLOQUEO: se realiza para evitar uniones inespecíficas. La solución de bloqueo consiste en suero de cabra al 3% en PBS1x con IGEPAL al 0.1% (al preparar la solución de bloqueodebemos de tener en cuenta que los Ac van disueltos en esta solución). Se lleva a cabo durante 1h a 25ºC. Se realiza en cámara húmeda (30-50 μL por muestra).

7. ANTICUERPO PRIMARIO: se incubadurante 18-24h (a 4ºC) con el anticuerpo primario disuelto en solución de bloqueo. La dilución del anticuerpo primario es variable, así que hay que poner a punto este aspecto del protocolo para cadaanticuerpo, estando en general las diluciones dentro del rango 1/50 - 1/150. Se realiza en cámara húmeda (30-50 μL por muestra).

Día 2
8. LAVADOS: se realizan 3 lavados de 10 min cada uno en PBS 1X.9. ANTICUERPO SECUNDARIO: dilución del anticuerpo (1/500) en solución de bloqueo. Se realiza en cámara húmeda (30-50 μL por muestra) durante 2h.

10. LAVADOS: se realizan 3 lavados de 10min cada uno en PBS 1X.

11. INCUBACIÓN CON AVIDINA-PEROXIDASA: El complejo avidina-peroxidasa de rábano (Extravidin Sigma) se diluye a una dilución 1:300 en PBS 1x. Se realiza en cámara húmeda...
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