Práctica de electroforesis

SEPARACIÓN DE MOLECULAS DE ADN DEL TOMATE POR ELECTROFORESIS CON GEL DE AGAROSA

OBJETIVO
Aprender el procedimiento de separaración de moléculas a través de la electroforesis en gel de agarosa.
INTRODUCCIÓN
Existen muchas maneras de separar moléculas biológicas una de los métodos más empleados es la electroforesis la cual consiste en la separación del ADN y proteínas con base en lacarga eléctrica que poseen. Muchas macromoléculas biológicas importantes (por ejemplo, los aminoácidos, los péptidos, las proteínas, los nucleótidos y los ácidos nucleicos) poseen grupos ionizables y, a un pH determinado, existen en solución como especies cargadas eléctricamente, sean cationes (+) o aniones (-). Según la naturaleza de la carga neta, las partículas cargadas migrarán hacia el cátodo ohacia el ánodo. Así, por ejemplo, cuando se aplica un campo eléctrico a un gel con pH neutro, los grupos fosfato del ADN cargados negativamente lo harán migrar hacia el ánodo (Westermeier, 1997). De una manera muy rustica se obtuvo una mezcla de ADN e impurezas de tomate la cual se utilizo para observar las bandas de ADN, para empezar la práctica fue necesario determinar la concentración yvolumen del gel así como familiarizarse con el material y equipó Se debe tubo precaución y cuidado con la manipulación del bromuro de etidio ya que es altamente cancerígeno.
MARCO TEORICO
La electroforesis en gel es una técnica que se emplea para separar los ácidos nucleicos y las proteínas. La separación de las macromoléculas depende de dos variables: carga y masa. Cuando una muestra biológica,como por ejemplo el ADN, se mezcla en una solución tampón y se aplica a un gel, esas dos variables actúan conjuntamente. La corriente eléctrica de un electrodo repele las moléculas, al tiempo que el otro electrodo las atrae. La fuerza de fricción del material de gel actúa como «tamiz molecular», separando las moléculas en función de su tamaño. Durante la electroforesis, las macromoléculas sonempujadas a través de los poros, dependiendo su tasa de migración por el campo eléctrico de los siguientes factores:
• Fuerza del campo
• Tamaño y forma de las moléculas
• hidrofobicidad relativa de las muestras
• fuerza iónica y temperatura del tampón en que se desplazan las moléculas
La agarosa, coloide natural que se extrae de las algas, es un polisacárido lineal (con un peso molecularmedio de ~12 000 Da) formado por la repetición de la unidad básica, la agarobiosa, que comprende unidades alternadas de galactosa y 3,6-anhidrogalactosa. La agarosa es muy frágil y las manipulaciones pueden destruirla con facilidad. Los geles de agarosa poseen grandes «poros» y se emplean fundamentalmente para separar las moléculas grandes con un peso molecular de más de 200 kDa. Los geles de agarosapermiten una electroforesis rápida, pero con una resolución limitada por cuanto las bandas que se forman en los geles tienen tendencia a ser difusas y a esparcirse. Ello obedece al tamaño de los poros y no puede controlarse. Los geles de agarosa se obtienen por suspensión de agarosa seca en polvo en un tampón acuoso, tras lo cual se hace hervir la mezcla hasta que la agarosa se funde y seconvierte en una solución transparente. A continuación, se vierte esta solución en un molde para gel y se deja enfriar a temperatura ambiente hasta que se forma un gel rígido. Al endurecerse, la agarosa forma una matriz cuya densidad viene determinada por su concentración. La movilidad electroforética del ADN se ve afectada por la composición y la fuerza iónica del tampón de electroforesis. En ausencia deiones, la conductancia eléctrica es mínima y el ADN migra lentamente o ni siquiera se desplaza. En un tampón de elevada fuerza iónica la conductancia eléctrica es muy elevada y se genera una importante cantidad de calor. En el peor de los casos, el gel se funde y el ADN se desnaturaliza. Se dispone de varios tipos de tampones para la electroforesis de ADN nativo Contienen EDTA (pH 8,0) y...