prácticas de Bioquímica general

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PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA GENERAL
2º CURSO
LICENCIATURA DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
UNIVERSIDAD DE SEVILLA
CURSO 2005/2006

NOMBRE:_________________________________________________________

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PRACTICA 1
PURIFICACION DE UNA ENZIMA: LA LISOZIMA DE HUEVO
OBJETIVO : Purificar la enzima lisozima a partir de la clara del huevo mediante cromatografía
de intercambio catiónicoutilizando carboximetilcelulosa. Determinar la actividad de la lizosima
en las diferentes fracciones de purificación.

INTRODUCCIÓN
El nombre de lisozima o muramidasa (EC 3.2.1.17) incluye a un grupo de enzimas que
catalizan la hidrólisis de enlaces glicosídicos β(1→ 4) de los polisacáridos de la pared celular
bacteriana. Son proteínas globulares constituidas por una sola cadenapolipeptídica (129
aminoácidos para la lisozima de Gallus gallus) y de peso molecular comprendido en el rango de
14 a 30 KDa. Estas proteínas contienen cuatro puentes cruzados disulfuro que contribuyen a
su elevada estabilidad. La lisozima fue la primera proteína secuenciada, la primera enzima de la
que se dispuso de un modelo tridimensional (usando cristalografía de rayos x) y la primera para la
que sepropuso un mecanismo de acción detallado.
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
La cromatografía de intercambio iónico se fundamenta en las propiedades ácido-base de
las proteínas. Una proteína, a pH menor de su pI (punto isoeléctrico), tendrá carga positiva y a
pH mayor de su pI presentará carga negativa. Por lo que, en el primer caso, se unirá a una
resina con carga negativa(Carboximetil-celulosa, CM-celulosa) y en el segundo a una resina con
carga positiva (Dietilaminoetil-celulosa, DEAE-celulosa).

Una vez unida la proteína a las resinas, estas se pueden eluir de dos formas distintas:
1) variando el pH del medio hasta alcanzar el pI
2) mediante un gradiente iónico añadiendo el contraión correspondiente (Na+ en el caso
de intercambio catiónico o Cl- para el intercambioaniónico)

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Dado que el pI de la lisozima es de 11, dos unidades de pH superior al del resto de las
proteínas de la clara del huevo, a un pH de 9,5 - 10 la lisozima es prácticamente la única
proteína con carga positiva neta. Ello permite separar esta enzima del resto de proteínas
mediante la utilización de resinas intercambiadoras de cationes.
La CM-celulosa es, debido a la presencia de restoscarboxilo ionizados a pH neutro y
básico, una resina intercambiadora de cationes. A pH 10, la lisozima es prácticamente la única
proteína que puede unirse a la CM-celulosa. Posteriormente, puede disociarse de la resina
mediante lavados con un tampón de alta fuerza iónica.
MATERIALES Y METODOS
•
Huevos de gallina para la obtención de la enzima.
•
Tampón A: glicina/NaOH 100 mM, pH 10
•Tampón B: glicina/NaOH 100 mM, pH 10, conteniendo 0.6 M NaCl
•
Carboximetil-Celulosa
Activación de la CM: previamente a su utilización, la resina se lava con HCl 0.5
M (5 minutos), 2 veces con H2O (hasta pH neutro), NaOH 0.5 M (5 minutos) y
finalmente dos veces con H2O (hasta pH neutro). Por último se hace una
suspension 1/1 (vol/vol) en tampón glicina/NaOH 100 mM pH 10
•
Tampón fosfato sódico100 mM, pH 6,2
•
Suspensión de la bacteria Micrococcus Lvsodeikticus 20 mg en 100 ml del
tampón fosfato anterior
A. PURIFICACION DE LA LISOZIMA
1. Recoger la clara procedente de un huevo. Diluirla 1/5 (vol/vol) con tampón A. Tomar 10
ml de la muestra anterior en un tubo cónico con tapón de 15 ml.
2. Antes de comenzar la purificación de la lisozima separar una alícuota de 1 ml para medir
laactividad de la enzima en la fracción de partida.
3. A los 9 ml restantes (Fracción O, Fo), añadir 4 ml de CM-celulosa previamente
activada y agitar suavemente durante 15 min, para que la lisozima se adsorba a la
resina.
4. Al finalizar la incubación, centrifugar la muestra a 600 rpm durante 3 min. Guardar el
sobrenadante (Fracción 1, F1).
5. Añadir a la resina (precipitado) 10 ml de...