PURIFICACION DE PROTEINAS Y TECNICAS DE CARACTERIZACIÓN

LA PURIFICACIÓN DE LAS PROTEINAS Y TECNICAS DE CARACTERIZACIÓN
Existen muchas proteínas diferentes en una sola célula. Un estudio detallado de las propiedades de cualquier proteína requiere una muestra homogénea que contenga un solo tipo de molécula. La separación y aislamiento, o purificación, de las proteínas constituye un primer paso esencial para la experimentación posterior. En general,las técnicas de separación se enfocan en propiedades como el tamaño, la carga y la polaridad, que son la fuente de diferencias entre las moléculas.
La columna de recuperación porcentual rastrea cuánto de la proteína de interés se ha retenido con cada paso. Esta proporción normalmente va decayendo en forma constante durante la purificación y se espera que en el momento en que la proteína logra unestado de pureza, aún quede suficiente producto para su estudio y caracterización. La columna de actividad específica compara la pureza de la proteína en cada paso, y este valor debe ir acrecentándose si la purificación se considera exitosa.
El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular, para posteriormente poder extraer la proteína con un tampón adecuado. El método derotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos ellos están:
Lisis celular. Válido para células sin pared celular como las células de tejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias. Consiste en suspender las células en una solución hipotónica (másdiluida que el interior celular). Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura.

Destrucción mécanica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas de vidrio, la prensa deFrench (que hace pasar las células
a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla. Los cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la acción de las proteasas (enzimas que hidrolizan losenlaces peptídicos) son los principales factores que pueden desnaturalizar las proteínas. Para evitar o minimizar estos factores la manipulación de las proteínas durante el proceso de purificación suele llevarse a cabo en disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4ºC) y se procura que el proceso sea lo más corto posible, además en ocasiones es necesario añadir el tampón de extracción agentesprotectores de grupos funcionales específicos de la proteína o bien inhibidores de proteasas.
El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas, membranas y células rotas. Esta preparación se somete a centrifugación (10.000 – 15.000 rpm) para eliminar los restos celulares y separar el sobrenadante, que contiene las proteínas solubles, delprecipitado que además de restos celulares también contienen proteínas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un tratamiento adicional con detergentes. En cualquier caso, la fase soluble (con o sin detergente) constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés objeto de la purificación. A la hora de centrifugar hay que tener en cuenta que la centrífuga searefrigerada, balancear los tubos y asegurarse siempre que los rotores estén fijos.
Para purificar una proteína es imprescindible tener un método para detectar cuantitativamente su presencia. Es deseable que este método sea específico y fácil de llevar a cabo. En este sentido es mucho más cómodo trabajar con enzimas, pues se detectarían mediante su ensayo de actividad, en caso de purificar proteínas no...