Reaccion en cadena de la polimerasa

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La reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR) (Saiki et
Al, 1985; Mullis et Al, 1987) permite la amplificación de secuencias específicas de ADN,
generando millones decopias a partir de una sola molécula de ADN. Es un método simple
que provee alta sensibilidad en la detección, al menos semejante a la del cultivo, combinada
con la especificidad de las sondas. En unprimer paso, el ADN es desnaturalizado a 94
0C. En
un segundo paso, balo condiciones experimentales adecuadas, los iniciadores (prirners) de la
reacción, oligonucleótidos de 15 a 30 pares de bases(p.bj, hibridan en secuencias del genoma
conocidas y separadas de 100 a 2000 p.b. del ADN diana o molde. Cada iniciador se une a
una cadena, con sus extremos 3’ apuntándose entre sí. La temperatura deesta hibridación
depende de la longitud de los iniciadores y de su proporción en G+C; en cualquier caso, a
más temperatura la especificidad de la reacción es mayor. En el tercer paso, el fragmentodel
ADN localizado entre los iniciadores es rápidamente amplificado utilizando una enzima
polimerasa de ADN procedente de la bacteria Thermus aquaticus, que actúa a 720C. Esta
amplificación selleva a cabo añadiendo desoxinucícótidos trifosfato, complementados a la
cadena de ADN molde, en los extremos 3’ de los iniciadores. Por lo tanto, el fragmento de
ADN se duplica en cada ciclo,obteniéndose una copia de cada una de las cadenas. La
reacción vuelve a repetirse 30 o 35 ciclos, obteniendo replicaciones sucesivas,
Al finalizar 35 ciclos, la cantidad de ADN es teóricamente ~ aunque lasaturación
de la enzima, la hibridación del ADN diana y otros factores limitan la amplificación. Sin
embargo, el rendimiento obtenido con esta reacción es suficiente, y el producto de la reacciónpuede ser detectado por hibridación (0,3 pg de ADN) o por electroforesis en gel de agarosa
con tinción de bromuro de etidio (1-10 ng) (McFadden et Al, 1990). La sensibilidad
extremadamente alta de la...
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