Recombinación

Departamento de Ciencias Biológicas
Licenciatura en Biología
Profesores: Patricio Pérez y Ana Meneses
BIO247
17 septiembre de 2012


Ligamiento y Recombinación

Integrantes:
Diego Alzola
Jorge Fravega
Fernanda Guerrero
Camila Palma

Materiales y Métodos:
- Cepas de levaduras TSY812 y TSY813
- Zimoliasa 100T 10 tubos con 50 μl 0,05 mg/ml en 1Msorbitol.
- Medios de cultivo YPD, Esporulación (SPO), SD y Suplementos: -
- Plantillas para picar colonias (52 posiciones).
- Microscopios, porta y cubre objetos.
- Asas de cultivo.
- Alcohol (en 10 placas petri de vidrio con tapa).
- Rastrillos de vidrio.
- Mechero.
- Estufa de cultivo a 30°C.
- Mondadientes estériles (10 placas con 60 palillos cada uno).
- Micropipetas (100μl; 200 μl).
-Puntas amarillas para micropipetas.
- Tijeras.
- Hielo.
-Gradillas para tubos eppendorf.
-Tubos eppendorf estériles.

Experimento 1:.-Observación de células de levadura y formación de diploides:
Se tomó un cultivo con las especies de levaduras TYS812 y TYS813 dentro de una placa Petri, Se comenzó a observar cada una de ellas y a continuación se tomó nota de suscaracterísticas a plena vista. Luego de haber hecho esto con un aza estéril se extrajo un poco de cada especie de levadura y se colocó sobre un portaobjeto para llevarlo al microscopio. Luego se encendió el mechero previamente fijado con cinta, se tomó la placa YPD o de medio con suplementos donde se generó una fusión con las cepas previamente mencionadas.
Se rotuló la placa YPS con tresdivisiones, dos con el nombre de cada una de las levaduras y la sección intermedia como zona de fusión, con un aza previamente esterilizada a fuego lento, se removió un fragmento de cada una de las levaduras raspando suavemente con el aza y luego se depositó en cada una de las divisiones hechas en la placa YPD, y por ultimo se repitió este procedimiento pero en la zona de fusión mezclando cada una delas especies. Terminado esto se volvió a esterilizar el aza al fuego del mechero, se extrajo un poco de muestra de la zona de fusión para depositarlo en la placa de medio de esporulación (SPO*Lys).

Experimento 2: Obtención de esporas meiótica:
Luego de una semana de incubación se examinó los cultivos que se depositaron en el medio de esporulación SPO+LYS se extrajo un fragmento de la placa yse llevaron al microscopio para apreciar la formación de ascas al microscopio. Ya apreciada la formación de ascas se tomó la enzima zimoliasa, para romper la pared del asca y liberar así ascaesporas. Luego se incubó una muestra de las ascas llevándola al tubo con presencia de zimoliasa por 10 minutos a temperatura ambiente. Se deposito levadura con asa estéril en un tubo con 50 μL desolución zimoliasa, Se agitó suavemente . Luego, se llevó a centrifugar por 5 minutos y se detuvo la reacción agregando 150 μL de H2O y se trazlado la mezcla a hielo. Se hicieron diluciones en tres tubos eppendorf (-1 a -3) depositando alícuotas de 100 μL por cada una de los tubos. Las diluciones -2 y -3 se depositaron en medio completo (YPD) y las diluciones -1 y -2 medio SD máscanavanina (SD+CAN). Al verterse cada una de las diluciones en su correspondiente placa, se tomo el rastrillo esterilizado previamente en alcohol y repasado en fuego se comenzó a esparcir cada dilución repitiendo el proceso de esterilización por cada placa y por ultimo se incubo a 30° C hasta la próxima sesión.

Experimento 3: Replica en placas de medio mínimo consuplementos

Se analizaron las placas YPD y SD+CAN luego una semana de incubación a 30°, se procedió a contar las colonias tanto rojas como blancas, por cada placa de crecimiento. Tanto en YPD y SD+CAN, Luego se tomó pequeñas muestras de las colonias que lograron crecer, a medios con SD mas suplementos adecuados, para lograr determinar el genotipo de Saccharomyes Cerevisiae. Se tomaron placas con...